[发明专利]一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法

权利要求书

1.一种针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）利用寡聚核苷酸链从各种来源的细胞样本中获取含有所有被转录的mRNA的全长cDNA文库；

（2）利用核酸碎片化技术将所获取的全长cDNA文库片段化成100-2000 bp大小的DNA片段；

（3）将被片段化的DNA片段插入含有两种不同类型报告基因的双顺反子质粒载体中，并使质粒载体在不同细胞中表达；

（4）根据两段顺反子基因的表达情况比值，并通过活细胞分选系统将携带潜在活性IRES元件的细胞分选出来，利用针对mRNA链5’-端帽子结构及3’-端下游报告基因序列设计的寡聚核苷酸，通过逆转录从样本中获取全长的含有上游报告基因、插入序列、下游报告基因的cDNA文库，并对不同比值强度组cDNA文库利用核酸序列码进行标记；所述的核酸序列码是可以被添加在报告基因序列两端的核苷酸片段；

（5）通过长读长测序技术对各组片段进行测序，并通过测序结果判断片段是IRES元件还是启动子或者可变剪切位点；

其中，步骤（1）中所述的寡聚核苷酸链包括两条分别能结合于mRNA链上的5’-端帽子结构及3’-端多聚腺苷酸尾巴序列，和一对序列相同的能用于扩增cDNA文库的寡聚核苷酸链；步骤（2）中所述将所获取的全长cDNA文库片段化成100-2000 bp大小的DNA片段，是利用TN5转座酶和针对TN5转座酶设计的转座子-酶切位点的由核苷酸组成的接头对，实现cDNA文库进行片段化，并使双链DNA片段化后长度范围处于100-2,000 bp之间；步骤（3）中所述的含有两种不同类型报告基因的双顺反子质粒载体的骨架为慢病毒载体，双顺反子为可发射不同波长荧光的上游红色荧光蛋白和下游绿色荧光蛋白，所述上游红色荧光蛋白的终止密码子之后有三联终止密码子、发卡结构及多克隆位点序列；步骤（4）中所述的活细胞分选系统的内部元件可以检测荧光信号并对发射出不同荧光强度的活细胞进行区分并收集；步骤（4）中所述的寡聚核苷酸链包括两条分别能结合于mRNA链上的5’-端帽子结构及3’-端下游报告基因序列，和一对序列相同的能用于扩增cDNA文库的寡聚核苷酸链；步骤（5）中所述长读长测序技术检测的核酸片段长度范围为5 -50 kb，对于受启动子活性造成的假阳性结果片段，其上游顺反子序列会缺失，对于含有潜在剪切位点序列，其上游顺反子序列会受到一定程度的剪切，对于非特异性扩增，其下游序列不包含步骤（3）中所述双顺反子质粒载体所包含的下游顺反子序列，只有上下游顺反子均完整的序列才会被认为是IRES元件，并根据序列码序列判断IRES元件来源于荧光强度比值范围为多少的细胞群体，以此评估IRES元件的活性。

2.根据权利要求1所述针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法，其特征在于，步骤（1）中所述的寡聚核苷酸链序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法，其特征在于，所述核苷酸组成的接头对中的一组序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示；另一组序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求1所述针对多种来源细胞样本中内部核糖体结合位点元件的高通量鉴定方法，其特征在于，步骤（4）中所述的寡聚核苷酸链序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.3所示。