[发明专利]反义核酸

说明书

提供了允许人肌养蛋白基因中的外显子51高度有效跳跃的药物。本发明提供了反义寡聚物，其能使人肌养蛋白基因中的外显子51被跳跃。

本申请是申请日为2015年3月11日，发明名称为“反义核酸”，申请号201580012727.4的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及引起人肌养蛋白基因中的外显子51跳跃的反义寡聚物和包含寡聚物的药物组合物。

发明背景

杜兴(Duchenne)肌肉营养不良(DMD)是遗传性进行性肌肉营养不良的最常见形式，其影响约3,500名新生男孩中的一名。虽然运动功能在婴儿和儿童中与健康人鲜有不同，但是在约4至5岁龄的儿童中观察到肌无力。然后，约12岁龄时肌无力进展到离床活动丧失，和至二十几岁进展至由于心脏或呼吸功能不全而死亡。DMD是此类重度病症。目前，不能获得用于DMD的有效疗法，并且已经强烈期望开发新的治疗剂。

已知DMD是由肌养蛋白基因中的突变引起的。肌养蛋白基因位于X染色体上，并且是由220万个DNA核苷酸对组成的巨型基因。DNA被转录成mRNA前体，并且内含子通过剪接而被除去以合成11,058个碱基的mRNA，其中79个外显子连接在一起。此mRNA被翻译为3,685个氨基酸以制备肌养蛋白。肌养蛋白与肌细胞中膜稳定性的维持有关，并且对于使肌细胞变得脆性较小是必要的。来自DMD患者的肌养蛋白基因含有突变，因此，在肌细胞中功能性的肌养蛋白很少被表达。因此，肌细胞的结构在DMD患者的身体中得不到维持，导致钙离子大量流入肌细胞中。因此，发生炎症样应答以促成纤维化，使得肌细胞仅可以艰难再生。

贝克尔(Becker)肌肉营养不良(BMD)也是由肌养蛋白基因中的突变引起的。症状牵涉伴随肌肉萎缩的肌无力，但是在与DMD相比时肌无力的进展通常是轻度并且缓慢的。在许多病例中，其在成年人中发作。认为DMD和BMD之间的临床症状的差异存在于将肌养蛋白mRNA翻译成肌养蛋白时氨基酸的阅读框被突变破坏与否(非专利文献1)。更具体地，在DMD中，突变的存在使氨基酸阅读框移位，从而消除了功能性肌养蛋白的表达，而在BMD中，制备了发挥功能(尽管不完全)的肌养蛋白，因为氨基酸阅读框是保留的，而外显子的一部分通过突变而缺失。

预期外显子跳跃充当用于治疗DMD的方法。此方法牵涉修改剪接以恢复肌养蛋白mRNA的氨基酸阅读框，并且诱导具有部分恢复的功能的肌养蛋白的表达(非专利文献2)。作为外显子跳跃的靶标的氨基酸序列部分会丧失。出于此原因，通过此治疗表达的肌养蛋白比正常蛋白变得更短，但是由于维持了氨基酸阅读框，部分保留了稳定肌细胞的功能。因此，预期外显子跳跃会导致DMD呈现与较轻的BMD的症状相似的症状。外显子跳跃方法已经通过使用小鼠或犬的动物测试，并且目前在人DMD患者的临床试验中评估。

可以通过靶向5'或3'剪接位点或5'和3'剪接位点两者，或外显子-内部位点的反义核酸的结合诱导外显子的跳跃。外显子仅当其两个剪接位点都被剪接体复合物识别时会被包含在mRNA中。因此，可以用反义核酸靶向剪接位点诱导外显子跳跃。此外，认为SR蛋白对外显子剪接增强子(ESE)的结合对于外显子被剪接机制识别是必要的。因而，也可以通过靶向ESE诱导外显子跳跃。

由于肌养蛋白基因的突变可以随DMD患者而变化，需要基于相应的遗传突变的位点或类型设计反义核酸。过去，Steve Wilton等,西澳大学(University of WesternAustralia)制备了诱导针对所有79个外显子的外显子跳跃的反义核酸(非专利文献3)，并且荷兰的Annemieke Aartsma-Rus等制备了诱导针对39个外显子的外显子跳跃的反义核酸(非专利文献4)。

认为可以通过使外显子51(下文称为“外显子51”)跳跃治疗所有DMD患者中的约13％的患者。近年，多个研究组织报告了靶向肌养蛋白基因中的外显子51进行外显子跳跃的研究(专利文献1至6；非专利文献5至6)。然而，尚未建立以高效率使外显子51跳跃的技术。

现有技术文献

专利文献