[发明专利]一种可有效表达外源蛋白的棒状杆菌ATCC 13032改良菌种以及构建方法

权利要求书

1.一种可有效表达外源蛋白的棒状杆菌ATCC 13032改良菌种，其特征在于，所述改良菌种为谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基础上敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中的cglIM基因、前噬菌体基因组得到的菌种。

2.一种可有效表达外源蛋白的棒状杆菌ATCC 13032改良菌种的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中的cglIM基因敲除；

步骤2：在步骤1的基础上，敲除前噬菌体基因组。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1具体为：选取cglIM基因的上下游片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增并胶回收；将该同源臂连接得到目标片段D，并将目标片段D连接到经双酶切的pK19mobsacB载体上得到质粒pK19mobsacB-D；将质粒pK19mobsacB-D转化进入到感受态棒状杆菌ATCC13032细胞中，通过同源重组得到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的cglIM基因缺失株，命名为ATCC13032-ΔDd缺失株。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2具体为：所述前噬菌体基因组包括基因Aa、基因Bb、基因Cc；

选取基因Aa、基因Bb、基因Cc的上下游片段作为同源臂，得到三组同源臂；通过PCR将每组同源臂扩增并胶回收；将每组同源臂连接得到目标片段A、B、C；并将目标片段A、B、C连接到经双酶切的pK19mobsacB载体上得到质粒pK19mobsacB-A、质粒pK19mobsacB-B、质粒pK19mobsacB-C；

将质粒pK19mobsacB-A转化进入到ATCC13032-ΔDd缺失株中，通过同源重组得到ATCC13032-ΔDdAa缺失株；

将质粒pK19mobsacB-C转化进入到ATCC13032-ΔDdAa缺失株中，通过同源重组得到ATCC13032-ΔDdAaCc缺失株；

将质粒pK19mobsacB-B转化进入到ATCC13032-ΔDdAaCc缺失株中，通过同源重组得到棒状杆菌ATCC 13032改良菌种；

其中，三组同源臂的引物分别为：

目标片段A的同源臂的引物：引物A-a1F，A-a1R和引物A-a2F，A-a2R；

目标片段B的同源臂的引物：引物B-b1F，B-b1R和引物B-b2F，B-b2R；

目标片段C的同源臂的引物：引物C-c1F，C-c1R和引物C-c2F，C-c2R；

引物A-a1F的核苷酸序列如SEQ NO.1中所示；

引物A-a1R的核苷酸序列如SEQ NO.2中所示；

引物A-a2F的核苷酸序列如SEQ NO.3中所示；

引物A-a2R的核苷酸序列如SEQ NO.4中所示；

引物B-b1F的核苷酸序列如SEQ NO.5中所示；

引物B-b1R的核苷酸序列如SEQ NO.6中所示；

引物B-b2F的核苷酸序列如SEQ NO.7中所示；

引物B-b2R的核苷酸序列如SEQ NO.8中所示；

引物C-c1F的核苷酸序列如SEQ NO.9中所示；

引物C-c1R的核苷酸序列如SEQ NO.10中所示；

引物C-c2F的核苷酸序列如SEQ NO.11中所示；

引物C-c2R的核苷酸序列如SEQ NO.12中所示。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，目标片段D的同源臂的引物：引物D-d1F，D-d1R和引物D-d2F，D-d2R；

引物D-d1F的核苷酸序列如SEQ NO.13中所示；

引物D-d1R的核苷酸序列如SEQ NO.14中所示；

引物D-d2F的核苷酸序列如SEQ NO.15中所示；

引物D-d2R的核苷酸序列如SEQ NO.16中所示。