[发明专利]定向进化构建高效转化白藜芦醇生产松芪的ROMT突变体

说明书

一种定向进化构建高效转化白藜芦醇生产松芪的ROMT突变体，属于基因工程技术领域。本发明的目的是通过易错PCR等诱变技术改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的可以定向进化构建高效转化白藜芦醇生产松芪的ROMT突变体。本发明通过定向进化构建的高效转化白藜芦醇生产松芪的ROMT突变体，由葡萄来源的VvROMT基因，运用易错PCR方法，通过多轮重组和随机突变，经定向进化而获得的ROMT突变体。本发明酶活力的提高可以用表达突变型ROMT工程菌转化白藜芦醇生产松芪的效率表示，表达突变型ROMT工程菌产松芪效率的提高，即代表了突变型ROMT转化白藜芦醇产松芪活性的提高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。

背景技术

松芪是一种白藜芦醇衍生物，发现于葡萄、蓝莓等植物中，具有抗毒素及抗氧化剂的作用。葡萄等多种植物有编码白藜芦醇O-甲基转移酶（ROMT）的基因，表达的ROMT可以使白藜芦醇的羟基甲基化，产生松芪或紫檀芪。相比白藜芦醇，松芪和紫檀芪稳定性更强，其中松芪在预防及治疗癌症方面比白藜芦醇更有效，松芪的市场价格比白藜芦醇和紫檀芪更高，松芪的高效生物合成方法有重要价值。

目前发现的多数ROMT，其产物以紫檀芪为主（Wang Y , Bhuiya M W , Zhou R ,et al. Annals of Microbiology, 2015, 65(2):817-826.），少数以松芪为主要产物的ROMT活性很低（Jeong Y J , An C H , Woo S G , et al. Enzyme and MicrobialTechnology, 2014, 54:8-14.）。表达葡萄来源ROMT（VvROMT）的大肠杆菌工程菌，可催化白藜芦醇转化为松芪和紫檀芪，产物以紫檀芪为主，松芪仅有微量的积累。表达高粱来源ROMT（SbROMT3）的大肠杆菌工程菌，产物虽然以松芪为主，但由于酶活性低，工程菌48h松芪产量仅有34 mg/L。

发明内容

本发明的目的是通过易错PCR等诱变技术改造酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的可以定向进化构建高效转化白藜芦醇生产松芪的ROMT突变体。

本发明通过定向进化构建的高效转化白藜芦醇生产松芪的ROMT突变体，由葡萄来源的VvROMT基因，运用易错PCR方法，通过多轮重组和随机突变，经定向进化而获得的ROMT突变体。

本发明VvROMT基因核苷酸突变方法：利用易错PCR技术在体外向VvROMT基因引入核苷酸突变：

易错PCR的反应条件如下

上游引物F：5’-caGGATCCggatctggcaaatggtgtgatcagtg-3’；

下游引物R：5’-atGCGGCCGCtcacggatacacttcaatcagactgcgcag-3’

PCR扩增条件：94 ℃ 3min；94 ℃ 1min，59 ℃ 1min，72 ℃ 2min，30个循环；72℃ 10min；

易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶BamHI和NotI分别对易错PCR扩增产物和质粒pRSF进行消化，连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；涂布于LB（含50 μg/mL卡那霉素）平板，37 ℃培养12h后，构成ROMT突变文库；

利用上述同样的方法，以突变体基因为模板进行多轮易错PCR，构建突变文库。

本发明ROMT突变体的获得：

用灭菌牙签将LB平板上生长出的卡那霉素抗性转化子复制到LB平板，其中含50 μg/mL卡那霉素，同时将对照菌大肠杆菌BL21(DE3)/pRSF-VvROMT接种至LB平板，其中含50 μg/mL卡那霉素，37 ℃培养12 h；