[发明专利]多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒，其特征在于，其用于同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫，该试剂盒包括如下引物：

细粒棘球绦虫G1的特异性引物：

Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；

Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示序列；

多房棘球绦虫的特异性引物：

Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示序列；

Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括对多重PCR反应体系和多重PCR反应条件的记载；所述多重PCR反应体系为：10×Reaction Buffer5μL；25.0mmol/L氯化镁3μL；10.0mmol/L dNTPMix 4μL；5U/μL TaqDNA聚合酶0.4μL；模板DNA各1μL；10μmol/L如权利要求1所述引物：细粒棘球绦虫G1上、下游引物各1μL，多房棘球绦虫上、下游引物各1.3μL；加无菌双蒸水补足至50μL；所述多重PCR反应体系的多重PCR反应条件为：95℃6min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括对以下多重RAA反应体系的记载：缓冲液25μL；模板DNA各1μL；10μmol/L如权利要求1所述引物：细粒棘球绦虫G1上、下游引物各1μL，多房棘球绦虫上、下游引物各1.5μL；280mmol/L醋酸镁2.5μL；加无菌双蒸水补足至50μL。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括对所述多重RAA反应体系的多重RAA反应条件的记载；所述多重RAA反应条件为：将以上多重RAA反应体系混合均匀，置水浴箱或PCR反应仪在37℃条件下反应40min。

5.一种细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的多重RAA与多重PCR检测方法，其特征在于，不用于疾病诊断，具体步骤包括如下:

(1)细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的虫体DNA提取；

(2)引物设计与筛选，设计的引物序列为：

细粒棘球绦虫G1的特异性引物：

Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；

Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示序列；

多房棘球绦虫的特异性引物：

Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示序列；

Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示序列；

(3)目的基因克隆；

(4)建立多重RAA以及多重PCR方法，对所设计的引物进行反应条件优化，得到最佳多重RAA以及多重PCR模式；

(5)按照步骤(4)RAA或PCR的反应条件进行RAA或PCR扩增特异性验证；

(6)按照步骤(4)的RAA或PCR反应条件进行RAA或PCR敏感性验证；

(7)按照建立的多重RAA以及多重PCR方法对样本进行检测和可行性验证。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫进行PCR扩增，PCR产物回收，将产物进行克隆测序，并获取质粒。