[发明专利]一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1及其重组质粒和应用

说明书

本发明提供了一种表达肝素酶的融合基因MBP‑H1及其重组质粒和应用，涉及肝素酶生产技术领域。本发明所述融合基因MBP‑H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，然后利用所述融合基因MBP‑H1构建pET‑28a‑MBP‑H1融合蛋白重组质粒，最后对pET‑28a‑MBP‑H1进行初步诱导表达条件优化，确定其最优诱导表达条件为在37℃，200rpm条件下培养至菌液OD600为0.7左右时，加入IPTG(100mM)至终浓度为0.1mM，30℃，200rpm诱导9h，肝素酶酶活最高可达4512U/L。

技术领域

本发明属于肝素酶生产技术领域，具体涉及一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1及其重组质粒和应用。

背景技术

目前市场上已有的几种肝素类药物大多都是由化学法制备，该方法处理过于激烈，容易导致肝素失去生物活性，使得该法制备的低分子量肝素具有微观非均相、多分散性和结构变异大等缺点。相比之下，酶法制备的反应条件更加温和，产物中不会引入有毒物质，反应效率高，而且肝素酶和产物易于分离，同时利用固定化酶技术还可实现生产的连续化，大大节约成本，是一种生产低分子量肝素的工业化途径。迄今为止，虽然有许多通过肝素酶裂解法制备低分子量肝素的研究报道，但仍然存在许多限制因素，例如肝素酶来源狭隘，许多制备低分子量肝素所用的肝素酶基本都是来源于肝素黄杆菌，此外肝素酶的制备成本较高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1及其重组质粒和应用，将该肝素酶基因构建麦芽糖结合蛋白-肝素酶融合蛋白，以提高其表达量和可溶性，有望解决工业上应用酶法制备低分子量肝素的瓶颈。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1，所述融合基因MBP-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述融合基因MBP-H1中H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述基因H1来源于拉乌尔菌(Raoultella sp.)NX-TZ-3-15，所述拉乌尔菌(Raoultella sp.)NX-TZ-3-15的保藏编号为CGMCCNo.13723。

本发明还提供了一种包含所述融合基因MBP-H1的重组质粒。

本发明还提供了所述重组质粒的构建方法，包括以下步骤：将所述融合基因MBP-H1克隆至载体pET-28a上，得重组质粒pET-28a-MBP-H1。

优选的，将所述融合基因MBP-H1插入载体pET-28a的XbaI和XhoI酶切位点之间。

本发明还提供了一种重组菌，包含所述重组质粒或利用所述构建方法构建得到的重组质粒。

本发明还提供了所述重组菌在生产肝素酶MBP融合蛋白中的应用。

优选的，在生产所述肝素酶MBP融合蛋白时，将所述重组菌在37℃、200rpm的条件下培养至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1mM后，于30℃、200rpm诱导所述肝素酶MBP融合蛋白的表达。

优选的，所述诱导的时间为9h。

本发明提供了一种表达肝素酶的融合基因MBP-H1，所述融合基因MBP-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，然后利用所述融合基因MBP-H1构建重组载体pET-28a-MBP-H1，最后确定其最优诱导表达条件为37℃，200rpm条件下培养至菌液OD600为0.7左右时，加入IPTG(100mM)至终浓度为0.1mM，30℃，200rpm诱导9h，肝素酶酶活最高可达4512U/L。

附图说明

图1为实施例1中目的基因与质粒的双酶切图；