[发明专利]检测厌氧氨氧化菌的方法

权利要求书

1.一种检测厌氧氨氧化菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

ⅰ)构建含有厌氧氨氧化菌的DNA片段的质粒；

ⅱ)将所述质粒导入感受态细胞中，并且对所述感受态细胞进行扩繁，提取扩繁后的感受态细胞中的质粒，对该质粒进行梯度稀释，获得不同浓度的质粒；

ⅲ)从污染物中提取厌氧氨氧化菌，提取该厌氧氨氧化菌的DNA；

ⅳ)同时对步骤ⅱ)获得的不同浓度的质粒和步骤ⅲ)获得的DNA进行荧光定量PCR，获得步骤ⅱ)获得的不同浓度的质粒分别对应的荧光强度和步骤ⅲ)获得的DNA对应的荧光强度；

ⅴ)根据步骤ⅳ)获得的不同浓度的质粒以及每个浓度的质粒对应的荧光强度，绘制标准曲线；

ⅵ)根据所述标准曲线和步骤ⅴ)获得的DNA对应的荧光强度，计算所述污染物中厌氧氨氧化菌的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤ⅰ)包括以下步骤：

a)获取厌氧氨氧化菌；

b)提取所述厌氧氨氧化菌的DNA，之后进行PCR，获得厌氧氨氧化菌的DNA片段；

c)将所述DNA片段导入载体中，构建含有厌氧氨氧化菌的DNA片段的质粒。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述DNA片段由如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物扩增制得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤ⅳ)中，所述荧光定量PCR的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述荧光定量PCR的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体为pGEMZ载体。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的检出限为10⁸～10¹³拷贝数/μl。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述污染物为污水或污泥。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤ⅲ)中，所述从污染物中提取厌氧氨氧化菌包括以下步骤：

将污水冷冻成固态，之后从固态升华成气态，从升华后的剩余物质中提取所述厌氧氨氧化菌。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将污水冷冻成固态，之后从固态升华成气态，从升华后的剩余物质中提取所述厌氧氨氧化菌包括以下步骤：

将污水冷冻成固态，之后在-20～-56℃的条件下，真空干燥，得到剩余物质，从所述剩余物质中提取所述厌氧氨氧化菌。