[发明专利]一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法

权利要求书

1.一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)合成VP1基因

根据GenBank公布的FMDV-SAT2-VII-VP1 JX014256基因优化序列为参考序列，在FMDVSAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP1基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57质粒为模板，设计特异性引物；

(2)PCR扩增

以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57重组质粒为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为50μL：Ex-Taq Mix 25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH₂O 21μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，进行35个循环，72℃延伸10min；将扩增产物进行凝胶电泳，观察并胶回收目的片段，于-20℃保存；

(3)pET32a-HisSUMO-VP1重组质粒的构建与鉴定

利用EcoR I和Xho I分别对pET32a(+)载体和VP1胶回收目的片段进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳，胶回收目的片段与载体，并且进行连接，取连接产物转化于E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养8h，挑取单菌落培养8h，12000r/min离心收菌体，提取质粒，对质粒进行PCR与酶切鉴定并测序；

(4)HisSUMO-VP1重组蛋白的小剂量诱导表达

将鉴定后的阳性质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂板培养后挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，200r/min，37℃培养2h，至OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入IPTG进行诱导表达，然后取1ml诱导后的菌液于6000r/min离心5min，沉淀用PBS溶液重悬，取样品，100℃煮沸10min；

(5)重组蛋白Ni-NTA树脂纯化

首先将Ni-NTA树脂用10倍含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液平衡树脂数次，对以可溶性形式表达的重组蛋白的上清液与Ni-NTA树脂4℃结合12h，然后用Wash Buffer洗涤杂蛋白，控制流速，最后用Elution Buffer洗涤目的蛋白，分别收集样品。

2.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物的基因序列如下：

上游引物：5‘-CGGAATTCCACCACCATCATCACCAC-3’，划下横线处为EcoR I限制性酶切位点；

下游引物5‘-CCGCTCGAGTTACAGGGTCTGACGCTCAACG-3’，划下横线处为Xho I限制性酶切位点。

3.如权利要求2所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，其特征在于，所述目的片段的大小为993bp。

4.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶切中所用的酶切体系为：VP1基因PCR胶回收产物或pET32a(+)载体各30μL，10×K Buffer 4μL，EcoR I 3μL，Xho I 3μL，总体体积为40μL，37℃水浴12h。

5.如权利要求4所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，其特征在于，步骤(3)中，进行连接时所用的连接体系为：pET32a(+)载体酶切后回收产物6μL，VP1基因酶切后回收产物分别为2μL，T4连接酶1μL，T4 Buffer 1μL，总体体积为10μL。

6.如权利要求5所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，其特征在于，进行连接的条件为：16℃过夜连接。

7.如权利要求1所述的南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，其特征在于，步骤(4)中，所述IPTG的终浓度为1mmol/L，所述诱导表达的条件为16℃诱导表达12h。