[发明专利]一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法

权利要求书

1.一种酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：在单水相或水/有机溶剂的双相反应体系中，加入反式-肉桂酸，加入微量NAD(P)⁺或NAD(P)H，加入O₂源，加入还原型氢供体，然后加入反式-肉桂酸-4-单加氧酶和NAD(P)⁺还原酶，滴加碱液控制pH，控制反应温度；反应结束后反应液过滤除酶后浓缩，降温结晶可得反式-4-香豆酸；其中，反式-肉桂酸-4-单加氧酶的编号为：EC 1.14.14.91。

2.如权利要求1所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：当反式-肉桂酸-4-单加氧酶需要的辅酶为NADH时，反应体系中添加微量的NAD⁺或NADH；当反式-肉桂酸-4-单加氧酶需要的辅酶为NADPH时，反应体系中添加微量的NADP⁺或NADPH。

3.如权利要求1所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：所述O₂源为空气、氧气或H₂O₂。

4.如权利要求1所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：所述的碱为氨水、NaOH或KOH；pH控制范围为5.0～10.0，优选的，pH控制范围为6.0～8.0，优选的，pH控制范围为6.8～7.5。

5.如权利要求1所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：所述的还原型氢供体为葡萄糖、异丙醇、甲酸或甲酸盐。

6.如权利要求5所述酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：当还原型氢供体为葡萄糖时，反应中加入的NAD(P)⁺还原酶为葡萄糖脱氢酶；当还原型氢供体为异丙醇时，反应中加入的NAD(P)⁺还原酶为异丙醇脱氢酶；当还原型氢供体为甲酸或甲酸盐时，反应中加入的NAD(P)⁺还原酶为甲酸脱氢酶。

7.如权利要求1-6任一项所述的酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶包括但不限于具有以下氨基酸序列的反式-肉桂酸-4-单加氧酶，所述的氨基酸序列可以是SEQ01、SEQ02、SEQ03、SEQ04、SEQ05、SEQ06、SEQ07、SEQ08、SEQ09、SEQ10、SEQ11、SEQ12、SEQ13、SEQ14、SEQ15或SEQ16；或所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶是具有所述氨基酸序列的单点和/或多点突变体的反式-肉桂酸-4-单加氧酶；或所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶是与所述氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列的反式-肉桂酸-4-单加氧酶。

8.如权利要求7所述的酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：用于表达所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶的宿主为大肠杆菌、芽孢杆菌、霉菌或酵母的一种；优选的，其表达体系为大肠杆菌BL21表达体系或者毕赤酵母GS115表达体系。

9.如权利要求8所述的酶催化法合成反式-4-香豆酸的方法，其特征在于：所述反式-肉桂酸-4-单加氧酶可以是所构建的宿主菌表达后的发酵液或菌泥，也可以是经简单处理的粗酶或经纯化处理的纯酶，还可以是经絮凝剂及陶瓷膜过滤后的液体酶或者是固定化处理后的固定化酶。