[发明专利]一种牛KLF3基因真核过表达载体的构建与应用

说明书

本发明公开了一种牛KLF3基因真核过表达载体的构建与应用。针对秦川牛KLF3基因编码区设计引物，并扩增对应的牛KLF3基因；构建pcDNA3.1‑KLF3重组过表达载体，并转染细胞。本发明通过克隆牛KLF3基因并构建真核过表达载体，可应用于牛KLF3基因功能研究、鉴定和调控肌肉生长发育。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种质粒型重组过表达载体pcDNA3.1-KLF3及其构建方法，该过表达载体可以在改造种子细胞和牛KLF3功能鉴定中应用。

背景技术

目前，基因表达已经成为生物学、医学和药物开发研究中的主流技术。基因过度表达为基因敲除的“合理逆转”。基因的过表达可以确保产生更多的信使RNA，也就会产生更多的蛋白质或下游产物。其能正调节一个基因的性能，便于研究基因在生物体内的功能。

目前已开发出许多可实现基因过表达的质粒载体。pcDNA3.1(+/-)载体是最常用的哺乳动物表达载体之一，其利用CMV promoter强启动子调控外源基因表达，载体拷贝数、表达量均较高，且无荧光标记，也不携带tag。并具有Amp+原核筛选抗性和Neo+真核筛选抗性，可以利用G418筛选稳定细胞株。pcDNA3.1(+/-)载体质粒大小为5.4Kb，具有多克隆位点区，含多种限制酶酶切位点，可以通过双酶切法整合目的基因以构建实现目的基因表达的重组质粒。

在分子生物学实验中，一般都会使用两种不同的限制酶同时处理目的基因和载体，以防止目的基因和载体出现自连或反向连接的现象。双酶切法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。

KLF家族因子是一类含有锌指结构域，并以此可以结合DNA中的GC-box或相关的CACCC元件的基本转录蛋白，其依靠对于含有特定GC-box启动子的基因的转录调控，及通过与辅助抑制因子羧基端结合蛋白(C-terminal binding protein,CtBP)相关联来抑制基因表达。KLF3又称为碱性KLF因子(Basic Kruppel-like factor,BKLF)，同其他KLF因子一样拥有锌指结构基团、核定位信号以及富含氨基酸的功能区，KLF3转录因子在C端通过Cys2-His2锌指结构域与目的序列结合。

2008年，在研究KLF3基因敲除的实验中发现了KLF3因子对脂肪生成分化过程的作用。在这个研究中，研究人员利用遗传工程小鼠为实验模型，通过对KLF3因子C端结合DNA的锌指结构的靶向性敲除来敲除KLF3基因，结果显示KLF3基因敲除后小鼠的出生率下降，经器官和体重检测，其相比同窝出生的正常小鼠体型更小。经过进一步的检测，发现小鼠体内脂肪垫中白色脂肪组织的体积和细胞的减少。此外，通过称量其他几个器官，然后相对于小鼠体积做校正之后，发现只有脂肪组织受到影响。在对脂肪细胞系3T3-L1的诱导分化研究中，KLF3因子的mRNA、蛋白表达水平化等的上调会抑制该细胞系向脂肪细胞分化。进一步的机制研究显示，KLF3通过抑制C/EBPα基因的表达抑制脂肪细胞分化。

2017年，朱才业利用选择信号检测方法，将每个显著的SNP位点向上下游各扩展50kb作为一个受选择的区域，在阿勒泰羊上检测出与脂肪相关的KLF3基因，为阿勒泰羊的分子育种提供了候选基因。Pértille等通过DNA测序及探针法检测了鸡KLF3基因的多态性，并与生长性状进行了关联分析，发现位于鸡4号染色体的KLF3基因的第一和第二内含子之间存在一个SNP位点TC，并与内脏重和胴体重等性状显著相关(P0.05)。

牛KLF3基因位于6号染色体上，有7个外显子，其基因全长为27143bp，编码346个氨基酸。目前KLF3基因在黄牛(例如，秦川牛)生长性能的标记辅助选择和新的优良品种的育种方面有少量研究报道，但KLF3因子对黄牛肉质性能的影响规律尚不清楚，亟需提出可以用于调控黄牛肌肉生长发育性状和牛肉品质的理论依据和实践途径。

发明内容