[发明专利]基于双纳米复合物的比色免疫传感器及其制备方法和应用

权利要求书

1.基于双纳米复合物的比色免疫传感器，其特征在于，包括：Fe₃O₄ @ Ab磷酸铜纳米复合物和Hemin @ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物；所述Fe₃O₄ @ Ab磷酸铜纳米复合物由Fe₃O₄、大肠杆菌抗体、PBS缓冲液、硫酸铜溶液制成；所述Hemin @ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物由高铁血晶素Hemin、抗菌肽Magainin I、PBS缓冲液、硫酸铜溶液制成；

所述基于双纳米复合物的比色免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、合成Fe₃O₄ @ Ab磷酸铜纳米复合物；

（1）将25µL、40mg/mL的Fe₃O₄和40µL、0.1mg/mL的大肠杆菌抗体加入到800µL、10mM、pH7.4的PBS缓冲液中；

（2）加入30µL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，震荡混匀，在25℃下孵育14h；

（3）10000转/分离心6 min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Fe₃O₄ @Ab磷酸铜纳米复合物；

步骤二、合成Hemin @ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物；

（1）将40µL、4mg/mL的高铁血晶素Hemin和40µL、1mg/mL的抗菌肽Magainin I加入到800µL、10mM、pH 7.4的PBS缓冲液中；

（2）加入20µL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，混合均匀，在25℃下静置14h；

（3）10000转/分离心6 min产生褐色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Hemin@ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。

2.如权利要求1所述的基于双纳米复合物的比色免疫传感器的非诊断目的的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、合成Fe₃O₄ @ Ab磷酸铜纳米复合物；

步骤二、合成Hemin @ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物；

步骤三、制备大肠杆菌O157:H7样品；

步骤四、利用Fe₃O₄ @ Ab磷酸铜纳米复合物和Hemin @ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物对大肠杆菌O157:H7样品进行检测。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤一具体包括以下步骤：

（1）将25µL、40mg/mL的Fe₃O₄和40µL、0.1mg/mL的大肠杆菌抗体加入到800µL、10mM、pH7.4的PBS缓冲液中；

（2）加入30µL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，震荡混匀，在25℃下孵育14h；

（3）10000转/分离心6 min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Fe₃O₄ @Ab磷酸铜纳米复合物。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤二具体包括以下步骤：

（1）将40µL、4mg/mL的高铁血晶素Hemin和40µL、1mg/mL的抗菌肽Magainin I加入到800µL、10mM、pH 7.4的PBS缓冲液中；

（2）加入20µL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至1mL，混合均匀，在25℃下静置14h；

（3）10000转/分离心6 min产生褐色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清，即得Hemin@ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤三和步骤四具体包括以下步骤：

（1）将大肠杆菌O157:H7菌株在Luria-Bertani肉汤培养液中于37℃孵育过夜，4500rpm离心10 min，PBS洗涤两次，并重悬于0.1mM、pH 7.4的PBS中，将细菌悬浮液在PBS中连续稀释10倍；

（2）将50μL不同浓度的大肠杆菌O157:H7悬浮液加入到离心管中，PBS缓冲液作阴性对照；

（3）加入2µL的Fe₃O₄ @ Ab磷酸铜纳米复合物，混合均匀，37℃下孵育1.5h，形成Fe₃O₄ @Ab-E.coli纳米复合物；

（4）用0.1mM、pH 7.4的PBS洗涤三次，采用磁铁分离，以除去未结合的靶标；

（5）加入8µL的Hemin @ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物，37℃下孵育30 min，以形成Fe₃O₄@ Ab磷酸铜纳米复合物-大肠杆菌O157:H7-Hemin @ MI纳米酶磷酸铜纳米复合物共轭夹心免疫复合物；

（6）磁分离后，用0.1mM、pH 8.0的PBS洗涤三次，以除去未结合的细菌细胞和非特异性结合部分，得到三明治式免疫复合物；

（7）将10µL、10mM的ABTS和5µL、30 mM的H₂O₂加入到三明治式免疫复合物中，混合均匀，反应5 min，观察颜色变化和ABTS的吸光度的峰值，颜色变化、ABTS的吸光度与大肠杆菌O157:H7产生定量关系。