[发明专利]一种基于类过氧化酶催化银沉积检测GPC3的方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的基于类过氧化酶催化银沉积检测GPC3的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：HGNs-Apt信号探针制备

（1）HGNs的制备

在室温下将GO分散于超纯水中，超声形成GO溶液，离心去除沉淀中颗粒较大的石墨烯粒子，取上清液；将Hemin溶于超纯水和氨水中；将GO溶液和Hemin的氨水溶液混溶，再加入水合肼，震荡，将其置于水浴锅中反应，冷却离心，再次溶于超纯水得到HGNs溶液；

（2）HGNs-Apt的制备

将GPC3适配体和HGNs溶液超声混合，室温孵育，缓慢加入NaCl溶液，进行老化，产物经离心洗涤后重新分散在Tris-EDTA缓冲液中，去除游离的适配体，即得HGNs-Apt信号探针溶液；

步骤2：丝网印刷电极的活化

将丝网印刷电极置于H₂SO₄溶液中进行循环伏安扫描，得到活化后的丝网印刷电极，用纯水冲洗干净；

步骤3：电极的修饰与生物传感界面的构建

（1）将活化后的丝网印刷电极进行纳米金的恒电位沉积，冲洗干净；

（2）移取GPC3-Apt的悬浮液，加在预处理好的电极表面，然后将电极放到孵育箱中孵育，即得到GPC3-Apt/Au NPs/SPCE修饰的工作电极；

（3）在GPC3-Apt/Au NPs/SPCE修饰的电极表面滴加GPC3标准液溶液，置于25℃孵育，即得到GPC3/GPC3-Apt/Au NPs/SPCE修饰的工作电极；

（4）在GPC3/GPC3-Apt/Au NPs/SPCE修饰的电极表面继续滴加HGNs-Apt探针溶液，孵育，纯水清洗，晾干得到HGNs-Apt/GPC3/GPC3-Apt/Au NPs/SPCE复合材料修饰的工作电极；

（5）最后在HGNs-Apt/GPC3/GPC3-Apt/Au NPs/SPCE电极表面滴加 H₂O₂和AgNO₃溶液，避光反应30 min，然后用甘氨酸-NaOH溶液将电极表面多余的AgNO₃冲洗干净，晾干备用；

步骤4：GPC3的工作曲线绘制

（1）在步骤3构建的1,5-AG电化学生物传感界面滴加GPC3标准溶液，放到孵育箱中孵育，得到GPC3电化学生物传感器；

（2）将上述的工作电极浸入到HNO₃-KNO₃溶液里面，用电化学工作站，采用差分脉冲伏安法进行扫描，记录传感器的响应电流值；

（3）根据传感器的电流响应值与GPC3浓度的关系，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限；

步骤5：待测样品中GPC3的检测

（1）在步骤3构建的GPC3电化学生物传感界面滴加的待测实际样品，放到孵育箱中孵育，用PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用；

（2）将工作电极放入HNO₃-KNO₃溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流（3）；根据步骤4所述工作 曲线，得到所述待测实际样品中GPC3的浓度。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中所述H₂SO₄溶液浓度为0.5 mol/L；扫描电压为-0.2 V~1.0 V，扫描圈数为10。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中所述用于纳米金的沉积溶液为浓度为0.01%的HAuCl₄，沉积电位为-0.5 V，沉积时间120 s。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中所述HGNs-Apt复合纳米材料浓度为1.0 mg/mL。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中所述GPC3-Apt浓度为10.0μmol/L。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4和步骤5中所述工作电极的孵育温度为37°C，孵育时间1h。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4和步骤5中所述DPV扫描所用HNO₃-KNO₃溶液中HNO₃浓度为0.1mol/L，KNO₃浓度为0.6mol/L；所述的DPV的扫描范围为-0.1V~0.6 V，扫描速率为100 mV/s。