[发明专利]一种产红没药烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与用途

说明书

本发明公开了产生红没药烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其用途，属于分子生物学技术领域。所述基因工程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入α‑红没药烯合酶基因、β‑红没药烯合酶基因或γ‑红没药烯合酶基因并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(HMGR基因)所得。基因工程菌在YPD培养基中摇瓶发酵后，基因工程菌Po1gΔku70α‑HR产α‑红没药烯的产量为100.22mg/L，基因工程菌Po1gΔku70β‑HR产β‑红没药烯的产量为5.66mg/L，基因工程菌Po1gΔku70γ‑HR产γ‑红没药烯的产量为3.55mg/L。经优化培养基后，菌株Po1gΔku70α‑HR产量为162.24mg/L，Po1gΔku70β‑HR产量为20.811mg/L和Po1gΔku70γ‑HR产量为6.25mg/L。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种产生红没药烯的解脂耶氏酵母基因工程 菌及其用途。

背景技术

解脂耶氏酵母是一种具有典型代表性的非常规酵母。该酵母无致病性，最高生长温 度一般在34℃以下，并且已经被认定为(generally regarded as safe,GRAS)安全级微生 物。与酿酒酵母不同，该酵母为严格好氧菌，所能达到的最大生物量值较大。解脂耶氏酵母的另外一个显著优点是它广泛存在于各类食物和各种生存环境中，这是因为该酵母可以利用的碳源类型极为广泛，包括有机酸、烷烃、烯烃、油类、醇类、酯类等各种廉 价碳源。此外，解脂耶氏酵母在其代谢过程中能够产生和(或)分泌多种代谢产物，因 此具有很好的工业用途价值。具体用途包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、赖氨酸、γ-癸内 酯、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸和单细胞油脂的工业生产和生物修复等。由于解脂 耶氏酵母具有以上这些生理、代谢特征和独特优势(尤其，微生物发酵工业的关键瓶颈 在于生产成本，尤以碳源为主)，因此解脂耶氏酵母在生物燃料、大宗化学品、精细化 学品、工业酶、药物等各种生物制品的工业化生产中都具有巨大的用途潜力(比大肠杆 菌和酿酒酵母更大的用途潜力)。

到目前为止，解脂耶氏酵母的全基因组测序工作已经完成，基因表达载体和遗传转 化方法也相继建立并不断发展完善。这些都为这一新型非模式微生物底盘细胞的开发利 用奠定了良好基础。近年来，利用代谢工程和合成生物学技术对解脂耶氏酵母底盘细胞进行改造来改进自身代谢产物的生产以及合成新的目标产物，已经成为目前的一个研究热点。红没药烯是一种植物来源的天然活性化合物，具有很高的市场价值。

红没药烯(bisabolane)属于单环倍半萜类天然产物，化学式为C₁₅H₂₄，根据双键位置的不同分为三种异构体：α-红没药烯、β-红没药烯、γ-红没药烯(参照附图1)。红没 药烯有类似果香和香脂的悦人香味，可以作为食用香精及日化香精使用，市场价值很大； 红没药烯也是极具潜力的新型生物燃料；红没药烯还具有抗痒、消炎、抗癌的医学价值。 此外，红没药烯也是多种高附加值工业产品合成的前体物质，如生物燃料、生物塑料、 化妆品、保健品及药品等。

目前红没药烯的工业生产主要还是通过植物提取法实现的。但这一方法存在很大弊 端，如植物来源有限、目标物质含量低和分离提取难度大等缺点；利用化学方法也能合成红没药烯，但化学合成法需要采用高温、高压和昂贵的催化剂，而且生产设备复杂， 原料利用率低、环境污染严重。随着人们对健康、能源和环境问题的愈加关注，掀起了 有着广泛用途前景的萜类化合物等植物天然产物的研究热潮。因此利用微生物生产这些 植物来源的天然产物就具有独特优势，也引起了越来越多研究者的关注。

目前关于利用微生物代谢工程技术生产红没药烯的研究并不多见，主要集中在大肠 杆菌和酿酒酵母这两种模式菌株中，但是产量并不高，难以实现工业化。针对红没药烯在大肠杆菌和酿酒酵母中合成产量低的问题，可能存在诸多原因，有待于进行进一步的 探索。而为红没药烯的生物合成寻找新的、更理想的微生物宿主是一个很好的研究方向， 借此可以找到红没药烯合成代谢通路与微生物宿主之间的最大兼容性。