[发明专利]与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用

说明书

本发明属于生物医学技术领域，公开了与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用，所述的核酸适配体是ssDNA，由82个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其二级结构含有突出的环和茎，其中DONA15吉布斯自由能DG＝‑8.84，且该适配体具有G‑四联体结构，该结构更稳定。基于酶联寡核苷酸吸附测定法(ELONA)进行核酸适配体特异性、亲和力和灵敏度等一系列性质评估，显示DONA15能特异性与呕吐毒素结合，因此该核酸适配体具有高特异性、高亲和力的特点，可在后续对呕吐毒素的快速检测在试纸条的应用中。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素(vomitoxin)，主要是由镰刀菌的某些种产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物——单端孢霉烯族化合物中的一种。DON的主要产生菌是禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，据报道也有其它一些镰刀菌可产生。DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。另外，它还常与其它的霉卤毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。近年来发现DON可能与人类食管癌、IgA肾病有关，对人类及动物的健康构成威胁。DON属于剧毒或中等毒物，研究表明，DON在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很强的细胞毒性。人畜摄入了被DON污染的食物/饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，但不同的动物对DON的敏感程度不一，猪是最敏感的动物。研究表明，DON可能对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。由于DON的危害严重，引起了各国的普遍重视。谷物及饲料中DON的含量有严格的限量标准。

核酸适配体(aptamer)是基于SELEX技术从随机寡核苷酸文库中筛选获得的对靶物质具有很高特异性与亲和力的寡核苷酸序列。人工化学合成一个文库容量为1014-1015nt的随机寡核苷酸文库，其总长度一般为70-100nt，中间包含20-40nt的随机序列。文库与靶标物质孵育一定时间后形成核酸-靶标的复合物，利用一定的方法除去未与靶标结合的文库序列，复合物热解离获得与靶标结合的序列，并以此为模板进行PCR扩增，进而制备下一级文库。经过8-20轮不断筛选获得对靶标具有高特异性与高亲和力的寡核苷酸序列，即适配体。适配体经克隆测序后获得相应核酸序列用于后续的研究。自此以来，适配体已经被广泛应用于细胞成像、新药研发、疾病治疗与微生物检测等众多方面，但目前并没有直接检测呕吐毒素方法或产品。

发明内容

未解决现有技术中存在的问题，本发明提出了与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体、制备方法及应用。具体是通过如下技术方案实现的：

与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体，具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

进一步的，所述与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能DG＝-8.84。

进一步的，所述与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体具有G-四联体结构。

进一步的，该适配体对应引物包括Aptamer Fw和Aptamer Rv，其中Aptamer Fw的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，Aptamer Rv的序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。

与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤一、筛选，采用SELEX技术通过能够偶联羟基的柱子筛选出能够与呕吐毒素特异性结合的核酸适配体群体；