[发明专利]一种酶法制备亚精胺的方法

权利要求书

1.一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建质粒pcwj-speD和质粒petduet-speE

（1）构建质粒pcwj-speD：

设置上游引物带有EcoR I酶切位点，序列1为CCGGAATTCTTGAAAAAACTGAAACTGCATGGC，

设置下游引物带有BamH I酶切位点，序列2为CGCGGATCCTTAAACAGCTGGCATATTGCGC，

大肠杆菌KA30的基因组DNA作为模板扩增得到片段speD,将保在DH5α中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点EcoR I和 BamH I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后，分别进行胶回收，完成后检测质粒浓度；使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有氯霉抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养8-12h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒pcwj-speD；

（2）构建质粒petduet-speE

设置上游引物带有BamH I酶切位点，序列3为CGCGGATCCAATGGCCGAAAAAAAACAGTGG，

设置下游引物带有Sal I酶切位点，序列4为ACGCGTCGACTTAGGACGGCTGTGAAGC，

大肠杆菌KA30的基因组DNA作为模板扩增得到片段speD，将保在DH5α中的pcwj质粒进行提取，选取酶切位点BamH I和 Sal I，将片段和质粒都进行双酶切操作，酶切完成后分别进行胶回收，完成后检测下质粒浓度，使用T4 DNA Ligase(Takara)将胶回收之后的质粒和片段进行连接后，转化感受态,涂板于带有氨苄抗性的平板上隔夜培养，待平板上长出单菌落后使用质粒通用引物进行菌落PCR验证，同时划线于相同抗性的平板上培养12-16h，经核酸凝胶电泳验证后挑选正确的阳性结果进行提质粒并经公司测序，确认插入序列无误即为成功构建质粒petduet-speE；

步骤2，菌株的诱导表达

（1）将验证构建成功的质粒分别转化到大肠杆菌BL21DE3中，涂布于对应抗性的平板上；

（2）菌体的诱导表达：将菌株BL21DE3-pcwj-speD,BL21DE3-petduet-speE分别接种至5mlLB液体培养基，千分之2的抗性，37℃，200rpm条件下培养至OD≈0.8，按百分之一的接种量接至100mL LB液体培养基，2‰抗性，37℃，200rpm条件下培养至OD≈0.6-0.8之间进行诱导，诱导剂用量为度0.5‰~2‰；

步骤3，催化生产亚精胺

在50ml反应小瓶中进行如下体系：称取100mg S-腺苷甲硫氨酸，100mg丁二胺盐酸盐，加入适量Mg²⁺和PLP后加入10mlPBS缓冲液，另外加入5-20ml BL21DE3-pcwj-speD粗酶液，1-5ml BL21DE3-petduet-speE粗酶液，使用pH计将pH调至6.5-8，反应10-16h，完成催化反应，检测反应液上清中S-腺苷甲硫氨酸的消耗以及亚精胺的生成情况。

2.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中扩增时的PCR体系为95℃ 2-5min ，95℃ 10-20s，55℃ 10-20s，72℃ 10-20s，共30个循环；72℃ 5-10min。

3.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中酶切时的体系30-37℃，1-2h。

4.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中将胶回收之后的质粒和片段进行连接的体系为10×Ligase buffer1-2ul，T4 DNA Ligase(Takara)1μl，基因片段5-7ul，载体1-2ul。

5.根据权利要求1所述的一种酶法制备亚精胺的方法，其特征在于，步骤1中感受态为Trans1-T1或DH5α。