[发明专利]检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试剂盒

说明书

本发明涉及兽医领域中的动物病毒检测技术领域，具体公开了一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试剂盒；基于该试剂盒的PCR方法不仅可特异地检测非洲猪瘟病毒野毒。与现有的p72的荧光PCR配合使用时，还可作为区分非洲猪瘟病毒野毒和MGF360‑505R缺失弱毒疫苗毒株的方法，从而为检测非洲猪瘟病毒野毒及其感染动物提供重要工具，以利于该病的控制和净化。

技术领域

本发明涉及兽医领域中的动物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种烈性、出血性传染病；强毒株可在感染的约5-14天内致死家猪，其中死亡率接近100％，而且难以扑灭。该病是世界动物卫生组织(OIE)规定的属于法定报告的动物疫病。自2018年8月我国发生首起非洲猪瘟疫情后，已给我国养猪业造成了非常沉重打击。

非洲猪瘟病毒自从发现100多年来，仅仅有西班牙、巴西等屈指可数的国家依赖扑杀策略成功控制住非洲猪瘟。但我国生猪饲养量巨大，仅仅依靠扑杀手段，成本太高，安全、有效的疫苗是控制我国非洲猪瘟疫情的迫切需求。但采用传统疫苗研制策略，包括灭活疫苗、自然弱毒或传代致弱疫苗等)、新型佐剂和亚单位疫苗等新型疫苗等研制策略，均未成功。

国外研究表明，非洲猪瘟病毒基因组178643至182578的片段缺失导致MGF505-11L，MGF100-1L，17L18L ASFV G ACD01870，I9R，I10L I11L阅读框的缺失，可导致病毒毒力显著降低，且作为弱毒疫苗可产生有效保护。我国的研究单位也证实，将基因I型的非洲猪瘟病毒进行MGF360-505R基因缺失，或进行CD2V与MGF360-505R基因联合缺失而得到的非洲猪瘟病毒基因缺失毒株，不仅充分致弱，而且作为疫苗是非常安全的。

目前，非洲猪瘟病毒MGF360-505R缺失弱毒疫苗毒株已展现了很好的安全性和保护效果；但该疫苗一旦应用于临床，现有的基于非洲猪瘟病毒P72基因等的检测技术将不能区分野生型毒株毒和疫苗毒，导致疫苗毒和野生型病毒检测均为阳性。这将极大干扰弱毒疫苗使用后，非洲猪瘟病毒野毒的检测，从而不利于该病的控制。

因此，急需研发MGF360-505R缺失弱毒疫苗使用后，仍可特异性检测非洲猪瘟病毒野毒的检测试剂盒和方法。从而在弱毒疫苗使用后，特异地检测并甄别野毒感染动物，从而为该病的防控提供重要工具。

发明内容

本发明针对应用MGF360-505R缺失弱毒疫苗防控非洲猪瘟后，需要检测非洲猪瘟病毒野毒感染动物进行淘汰的需求和技术问题时；提供了一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合及试剂盒，从而在疫苗使用背景下，为检测非洲猪瘟病毒野毒及其感染动物提供重要工具，以利于该病的控制和净化。

为实现上述目的，本发明所设计一种检测非洲猪瘟病毒野毒的实时荧光PCR引物探针组合，它包括荧光PCR特异性引物和荧光PCR探针；所述荧光PCR特异性引物的核苷酸序列为：

荧光PCR引物为：

上游引物：5’-TCTGCGTCAACTACCYCG-3’，

下游引物：5’-ATMGTCYTYACTTTCRTC-3’，

Y为C/T；M为A/C，R为A/G；

荧光PCR探针的核苷酸序列为：5’-TAAACTACTCCGTGAAAC-3’，且该荧光PCR探针的核苷酸序列的5’端结合有荧光报告基团，3’端结合有荧光淬灭基团。

进一步地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。