[发明专利]一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法

权利要求书

1.一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）试剂准备：LEP、APN检测ELISA试剂盒；

（2）仪器准备

（2-1）酶标分析仪；

（2-2）超低温冰箱；

（2-3）台式离心机；

（3）实验操作

（3-1）标本收集

真空负压管收集入选受试者的清晨空腹静脉血，静置30min后，利用台式离心机以3000rpm的速度离心10min后分离血清，置于-80 ℃超低温冰箱保存，待检LEP、APN；

（3-2）应用ELISA法测定血清APN及LEP水平

准备：提前20分钟将试剂从超低温冰箱取出，平衡室温；

配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水1:20稀释，备用；

标准品的溶解：

LEP标准曲线：每个标准品加入1.0 ml标本通用稀释液，室温放置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀；浓度为2000 pg/ml，然后依次稀释成1000 pg/ml、500 pg/ml、250 pg/ml、125 pg/ml、62.5 pg/ml、31.25 pg/ml和0 pg/ml；

APN标准曲线：每个标准品加入1.0 ml标本通用稀释液，室温放置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀，浓度为10 ng/ml，然后依次稀释成5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.25 ng/ml、0.625ng/ml、0.31 ng/ml、0.15 ng/ml和0 ng/ml；

编号：将样本对应微孔按序编号；

加样：检测APN时，血清用1:2500试剂配套通用稀释液稀释待用，LEP直接加样，分别在相应的孔中加入空白、标准品和待测样本100μl，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃温育90分钟；

洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；

加生物化素抗体：提前20分钟用生物化抗体稀释液1:30稀释浓缩生物化素抗体配置生物素化抗体工作液，每孔加生物化素抗体100μl，用封板膜封板后置37℃温育60分钟；

洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；

加酶：提前20分钟用酶结合物稀释液1:30稀释浓缩酶结合物配置酶结合物工作液；每孔加入酶结合物100μl，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃，温育30分钟；

洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；

显色：每孔加入显色液A、B液各100μl轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；

测定：每孔加终止液100μl，轻拍混匀，设定酶标分析仪波长450nm，用空白孔调零后测定各孔OD值；

数据处理：使用多项式线性拟和方式进行数据处理，以各校准品扣除本底的OD值为纵坐标，各校准品的浓度为横坐标作图，得到标准曲线，样本中的LEP、APN的浓度根据标准曲线计算得出；

（3-3）根据结果计算LEP/APN比值。