[发明专利]一株强耐酸性乳酸杆菌菌株及其筛选、发酵工艺

权利要求书

1.一株强耐酸性乳酸杆菌菌株，其特征在于，所述乳酸杆菌菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株PBIL1-039，保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2019750，保藏时间为2019年9月25日。

2.根据权利要求1所述一株强耐酸性乳酸杆菌菌株，其特征在于，其筛选方法包括如下步骤：

(1)菌株分离纯化：取-80℃菌种室保藏的菌株冻干管，进行斜面转接活化，镜检无杂菌后，备用；

(2)取步骤(1)所得纯化菌株用接种环挑取2-3环转接到pH值为6.5-7.0的液体MRS培养基中，37℃需氧培养24h后，按4％的比例分别接种于pH＝3.0的酸性的MRS液体培养基中进行需氧培养，初步筛选获得耐酸特性菌株；对筛选获得的菌株按上述步骤进行耐pH＝2.0及0.3％胆盐能力检测；

(3)取步骤(2)检测所得优势菌株，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行体外抑菌活性检测，筛选对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较强抑菌活性的乳酸杆菌；

(4)采用步骤(3)所获得具有耐酸特性的菌株，自制实验室冻干粉，对获得的冻干菌粉进行pH＝2.0耐酸特性检测，进一步筛选获得具有较强耐酸特性的乳酸菌菌株。

3.一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039工业化大生产发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、菌种活化培养：

将MRS斜面培养基pH值调节至6.5-7.0，在121℃下湿热灭菌15-30min后备用；在灭菌操作台中打开安瓿瓶，用灭菌接种环分别挑取2-3环权利要求1或2所述强耐酸性乳酸杆菌菌株，均匀划线，接种于MRS斜面培养基，在需氧条件下于30-37℃培养24-36h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后活化1次备用；

步骤二、一级菌种培养：

在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得活化后的乳酸杆菌菌种，接种于200ml的MRS培养液中，需氧条件下于30-37℃培养24-36h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；

步骤三，二级种子液制备：

取步骤二制得乳酸杆菌MRS培养液接种到二级种子培养基中，接种体积比为3-4％；需氧条件下30-37℃培养18-24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；

步骤四，车间200L小罐培养：

取步骤三制得的二级种子液，按2-6％的体积比接种到200L小罐培养基中，于30-37℃培养12-16h，终止培养，得小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐；

步骤五，车间1T大罐发酵培养：

按2-4％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接1T大罐发酵培养基，30-37℃培养12h；发酵过程中每2h镜检菌体形态；发酵结束停罐静置4h后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，设置离心机温度为0-8℃，转速8000-10000rpm离心2-2.5h，获取菌泥。

4.根据权利要求3所述一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039的工业化大生产发酵工艺，其特征在于，步骤三中所述二级种子培养基以及步骤四中所述200L小罐培养基为ZW-1培养基，各成分及质量分数如下：葡萄糖3-5％，玉米浆干粉0.3-1.0％，蛋白胨1.8-2.5％，酵母膏0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.0％，硫酸镁0.015-0.02％，醋酸钠0.3-0.6％，硫酸锰0.02-0.05％，吐温-80 0.3-0.6％；

所述二级种子培养基中的玉米浆干粉采用玉米制备，其制备方法为：将玉米打浆，所得玉米浆经喷雾干燥即得玉米浆干粉，部分替代MRS配方中的氮源。

5.根据权利要求3所述一株强耐酸性乳酸杆菌菌株PBIL1-039的工业化大生产发酵工艺，其特征在于，步骤五中所述1T大罐发酵培养基为ZW-2培养基，各成分及质量分数如下：葡萄糖3-5％，玉米浆干粉0.3-1.0％，蛋白胨1.8-2.5％，酵母膏0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.0％，硫酸镁0.015-0.02％，醋酸钠0.3-0.6％，硫酸锰0.02-0.05％，吐温-80 0.3-0.6％，碳酸钙0.3-0.5％。