[发明专利]一种多重荧光PCR通用冻干保护剂及其应用

说明书

本发明公开一种多重荧光PCR通用冻干保护剂及其应用，所述冻干保护剂由以下组成：0.3~0.6M海藻糖、0.001~0.004M聚乙二醇8000、0.02~0.08M甘露醇，余量为纯化水。本发明公开的多重荧光PCR通用冻干保护剂不仅能够对多重荧光PCR试剂的冻干过程起到保护剂和赋形剂的作用，而且添加的保护剂成分简单，不影响多重荧光PCR的扩增反应。使用优化的冻干保护剂冻干后外观成型光滑，吸湿性能低，冻干前后试剂性能变化小，冻干后的产物稳定性好。优选的冷冻干燥程序，适应性较强，在采用本冻干保护剂下可适用于多种无甘油的酶反应体系。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地说，涉及一种多重荧光PCR通用冻干保护剂及其应用。

背景技术

多重荧光PCR(multiplex PCR)，它是在同一PCR反应体系中加入两对以上的引物、探针，从而在一个反应体系中对两种或两种以上不同的核酸片段进行PCR扩增检测，可以快速获得多重靶标的检测结果，显著缩短检测时间。

PCR试剂的冷冻干燥，是将配制的液态PCR检测体系添加冻干保护剂后，先预先冻结为固体，在真空条件下，利用水的升华，使物料低温脱水而达到试剂干燥的目的。在冷冻干燥过程中热敏性物质（酶）不会发生变性或失活，能保持原来的活性；冻干前后试剂体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象；干燥过程在真空下进行，氧气极少，易氧化的物质能够得到保护；冷冻干燥能排除95％～99％以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。冷冻干燥整个过程在低温中进行，PCR试剂活性不会受到影响。因此与常规液态PCR试剂相比冻干试剂有着常温稳定、摆脱冷链、即时活化、不相容试剂共存、无交叉污染等很多明显优势。

在生物制品的冻干保护剂的制剂过程中，糖类是重要的一类辅料。不同的糖对药品冷冻保护作用不同，二糖可能是最有效的保护剂，二糖中的蔗糖和海藻糖应用最为普遍，但海藻糖的保护作用远高于蔗糖。海藻糖具有较高的玻璃态转变温度（Tg），优良的水解稳定性，不会在冷冻过程中可发生水解，同时具有较高的水合性及更低的水扩散系数和更高的粘性。因此是常用的冷冻干燥保护剂。

多重荧光PCR体系的建立较为复杂，外源添加物的改变可能会导致多重PCR性能的改变。目前，市面上可进行多重PCR反应体系的酶系统很多，但能够直接进行冻干处理的多重PCR酶系统很少。其主要问题在于：1）没有合适的冻干保护剂，导致在冻干过程中，PCR系统中生酶活性下降。2）添加的冻干保护剂对PCR试剂的多重扩增性能影响很大，冻干后试剂整体性能下降。

目前构建多重荧光PCR检测冻干体系的主要流程是，首先构建多重PCR液态反应体系，其次筛选冻干保护剂的原料，再次优化包含冻干保护剂的多重PCR液态反应体系，最后优化冻干程序。整个过程时间周期长，工作量大，成本较高。

因此，开发一种适用性广，对多重荧光PCR反应体系性能影响较小，冻干效果较好的冻干保护体系存在迫切的需求。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种多重荧光PCR通用冻干保护剂，其优点是配方成分简单，对多重PCR扩增影响较小，冻干程序适应性广。

本发明的第二个目的在于提供多重荧光PCR通用冻干保护剂在多重荧光PCR检测中的应用，通过优化的冷冻干燥程序，使得冻干保护剂在多重荧光PCR检测中发挥最优效果。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种多重荧光PCR通用冻干保护剂，所述冻干保护剂由以下组成：0.3~0.6M海藻糖、0.001~0.004M聚乙二醇8000、0.02~0.08M甘露醇，溶剂为纯化水。

作为一个优选方案，所述冻干保护剂由以下组成：0.3M海藻糖、0.001M聚乙二醇8000、0.02M甘露醇，余量为纯化水。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：多重荧光PCR通用冻干保护剂在多重荧光PCR检测中的应用，其冻干条件为：