[发明专利]一种蛋白质水解度测定方法

权利要求书

1.一种蛋白质水解度的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将水解后的蛋白质溶液用缓冲液稀释成适当浓度的蛋白水解液；

（2）将蛋白水解液以高效凝胶过滤色谱法测定多肽分子量分布，计算不同分子量范围多肽的质量百分含量X_a，其中，a为相对分子量；

（3）结果与计算：

（a）样品中的多肽含量，按照下式计算：

多肽含量（%）= ΣX_a，

其中，a = 200Da-10000 Da；

（b）样品中游离氨基酸的含量，按照下式计算：

游离氨基酸含量（%）= X_a，

其中，a < 200 Da；

（c）蛋白水解度，按照下式计算：

蛋白水解度（%）= Σ（128X_a/a’），

其中，128为氨基酸平均分子量，

a’为不同分子量范围多肽的平均分子量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，蛋白水解液的浓度为20-200mg蛋白/mL。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述缓冲液的pH为6.5-8.0；所述缓冲液的浓度为20-50mmol/L。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲溶液，磷酸缓冲溶液，Britton-Robinson广泛缓冲溶液，Clark-Lubs缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述高效凝胶过滤色谱法的色谱条件如下：

色谱柱：Superdex peptide 10/300 GL；

流动相：0.10-0.20M NaCl、20-50mM pH 7.2磷酸盐缓冲液；

流速：0.2-1.0mL/min；

检测波长：214nm；

压力：不超过1.8Mpa；

进样体积：20-100µL。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，还包括制备标准曲线并计算准确多肽含量、游离氨基酸含量和蛋白质水解度的步骤：

（i）将一系列不同水解程度的蛋白质标准溶液按照步骤（1）-（3）的方法分别测定游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度；

（ii）将（i）中的一系列不同水解程度的蛋白质标准溶液测定游离氨基酸和多肽的准确含量及准确的蛋白质水解度；

（iii）以（i）中游离氨基酸含量为纵坐标，以柱前衍生高效液相色谱法测定的游离氨基酸准确含量为横坐标做游离氨基酸含量标准曲线；

以（i）中多肽含量为纵坐标，以三氯乙酸沉淀法的多肽准确含量为横坐标做多肽含量标准曲线；

以（i）中蛋白质水解度为纵坐标，以茚三酮比色法测定的准确的蛋白质水解度为横坐标做蛋白质水解度标准曲线；

（iv）将测定获得的蛋白水解液的游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度分别代入（iii）中的标准曲线，计算获得准确的游离氨基酸含量、多肽含量和蛋白质水解度。

7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，步骤（ii）和（iii）中，所述游离氨基酸含量测定方法选自纸层析法或柱前衍生高效液相色谱法；

所述多肽含量测定方法选自双缩脲法、邻苯二甲醛法、紫外吸收法或三氯乙酸法；

所述蛋白质水解度选自pH-state法、三硝基苯磺酸法、甲醛滴定法或茚三酮比色法。