[发明专利]一种制备虾夷扇贝肌肉单细胞悬液的方法

说明书

本发明涉及一种制备虾夷扇贝肌肉单细胞悬液的方法，属于海洋无脊椎动物细胞生物学技术领域，所述方法的具体步骤如下：将闭壳肌组织剪成1‑2mm³的小碎片；加入酶混合液进行完全消化，消化后转入离心管中，两次离心收集细胞沉淀物，细胞沉淀物中加入预冷的CMFSS溶液，吹打重悬细胞，过滤，再次加入缓冲液CMFSS，吹打重悬，即获得扇贝肌肉单细胞悬液；本发明方法能够实现低成本、快速、高效获得虾夷扇贝肌肉单细胞悬液，并保证解离的细胞保持良好活力，可应用于为其他海洋贝类细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立，为虾夷扇贝的单细胞、基因功能及遗传育种研究提供重要参考资料。

技术领域

本发明属于海洋无脊椎动物细胞生物学技术领域，涉及一种制备虾夷扇贝肌肉单细胞悬液的方法。

背景技术

虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)属于冷水性贝类，原产地分布于日本、俄罗斯远东及朝鲜等海域，是世界扇贝科中肉质最为优良的增养殖种类之一，目前是我国北方海水养殖贝类中经济价值最高的扇贝品种。虾夷扇贝的闭壳肌肥大鲜嫩、营养丰富，深受国内外消费者的亲睐，是水产市场上的高档畅销水产品。我国虽然是扇贝养殖大国，但还并不是扇贝养殖强国，存在遗传改良研究相对滞后、遗传基础研究相对薄弱、良种匮乏等问题，严重影响和制约着我国扇贝养殖产业的可持续发展。近年来，越来越多的养殖虾夷扇贝出现规格趋小、出柱率低等制约养殖产业发展的瓶颈问题。目前，探索提高虾夷扇贝闭壳肌重的育种途径，提高养殖生产经济效益，加快闭壳肌重性状的遗传改良进程，改良虾夷扇贝的品质性状，是虾夷扇贝产业可持续发展的必由之路。

扇贝成体组织和器官种类多种多样，包括外套膜、闭壳肌、肝胰腺、肾脏、血淋巴、鳃、心室、心耳、肠道、生殖腺等，这些都为扇贝的细胞培养提供了丰富的细胞资源。然而，不同的组织具有各自独特的生理特性，是导致贝类细胞培养成为世界性难题的主要原因。闭壳肌组织是扇贝的主要可食用部位，现存的实验技术仍不能获得细胞活力较好的扇贝肌肉单细胞悬液，制约着扇贝成体肌肉组织的细胞培养、细胞系的建立和功能基因验证等方面研究工作。因此，高效制备扇贝肌肉单细胞悬液有助于建立和优化扇贝成体组织细胞的体外培养技术，为贝类永生细胞系的建立提供重要的参考资料，并在扇贝功能基因、遗传育种等研究领域具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于制备虾夷扇贝肌肉单细胞悬液的方法，有助于快速、高效解离虾夷扇贝肌肉单细胞，制备高质量的单细胞悬液，对于海洋贝类细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立具有重要的应用价值。

一种制备虾夷扇贝肌肉单细胞悬液的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：

步骤一，取新鲜的闭壳肌组织，采用清洗液DPBS冲洗闭壳肌组织，将组织剪成1-2mm³的小碎片；

步骤二，向步骤一剪碎的组织块中加入酶混合液，置于28℃水浴中进行酶解消化35-45min，消化至组织块消失；

步骤三，将组织消化液完全转入新的离心管中；

步骤四，将步骤三的溶液在4℃条件下300×g离心1min，然后再将细胞上清液600×g离心5min，收集细胞沉淀物；

步骤五，将预冷的扇贝肌细胞解离专用缓冲液CMFSS加入收集的细胞沉淀物中，使用宽口无菌枪头轻轻吸吹3-5次重悬细胞；

步骤六，重复步骤五1次，将重悬的细胞混合液用40μm细胞筛过滤，在4℃条件下600×g离心5min，收集细胞沉淀物，并加入预冷的扇贝肌细胞解离专用缓冲液CMFSS，轻轻洗吹3-5次重悬细胞，即获得扇贝肌肉单细胞悬液；

步骤七，采用细胞计数板检测获得肌肉单细胞，利用0.4％台盼蓝染色方法检测单细胞的浓度和活性。

步骤一所述清洗液DPBS为PBS缓冲液中不包含钙镁离子，含有质量比0.04％胎牛血清BSA，并包含400U/ml的青霉素和链霉素；