[发明专利]一种碱基编辑器及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种碱基编辑器，其特征在于，所述碱基编辑器为PX459-U6-sgRNA-CBh-TadA-TadA*-D10A-Cas9-PURO重组质粒，所述PX459-U6-sgRNA-CBh-TadA-TadA*-D10A-Cas9-PURO重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的碱基编辑器的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤为：

（I）对PX459质粒进行双酶切获得PX459-U6-sgRNA-CBh-Cas9-PURO载体骨架；

（II）用带有双酶切位点的引物对pCMV-ABE质粒进行PCR扩增，回收PCR产物经双酶切获得TadA-TadA*-D10A表达框序列；

（III）利用连接酶将PX459-U6-sgRNA-CBh-Cas9-PURO载体骨架和TadA-TadA*-D10A表达框序列进行连接，获得PX459-U6-sgRNA-CBh-TadA-TadA*-D10A-Cas9-PURO重组质粒。

3.根据权利要求2中所述的碱基编辑器的制备方法，其特征在于，所述双酶切的酶分别为AgeI限制性内切酶和BglII限制性内切酶。

4.权利要求1所述的碱基编辑器在猪体细胞基因编辑中的应用，其特征在于，所述应用的方法为：

（1）确定待编辑基因的靶位点；

（2）根据基因的靶位点合成gRNA引物，然后将gRNA引物进行高温退火形成引物二聚体；

（3）利用限制性内切酶将碱基编辑器质粒进行线性化，然后与引物二聚体混合后进行连接，获得连接产物；

（4）将连接产物进行转化感受态细胞，涂平板培养，挑选阳性克隆，扩增细菌，纯化回收质粒；

（5）将纯化回收的质粒进行细胞转染；

（6）细胞转染后，再进行细胞传代培养；

（7）细胞传代培养后，加入抗生素进行细胞的抗性筛选；

（8）抗性筛选后，撤除抗生素继续进行细胞培养，直至长出单细胞克隆。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述限制性内切酶为BbsI限制性内切酶。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述步骤（5）细胞转染是采用Lipofectamine3000试剂进行细胞转染，所述细胞转染的时间为6h。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述步骤（6）细胞传代培养的密度为1万/35mm直径培养皿，所述细胞传代培养的时间为2天。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述步骤（7）抗生素为嘌呤霉素，所述嘌呤霉素的使用量为1μg/mL，所述细胞抗性筛选的时间为72h。