[发明专利]维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒及方法有效
| 申请号： | 201911183883.3 | 申请日： | 2019-11-27 |
| 公开（公告）号： | CN111560445B | 公开（公告）日： | 2023-08-22 |
| 发明（设计）人： | 徐先栋;付辉云;陈文静;周智勇;饶毅 | 申请（专利权）人： | 江西省水产科学研究所;青岛英赛特生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/01 |
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| 地址： | 330000 *** | 国省代码： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 维氏菌 伊丽莎白 摩氏菌 qpcr 试剂盒 方法 | ||
1.维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，其特征在于包括以下引物对和探针：
检测维氏气单胞菌的引物对和探针Aer-ve-Pro，所述检测维氏气单胞菌的引物对包括SEQ ID NO：1所示的上游引物Aer-ve-F和SEQ ID NO：2所示的下游引物Aer-ve-R，所述探针Aer-ve-Pro的序列为SEQ ID NO：7所示；
检测伊丽莎白菌引物对和探针Eliz-Pro，所述检测伊丽莎白菌引物对包括SEQ ID NO：3所示的上游引物Eliz-F和SEQ ID NO：4所示的下游引物Eliz-R，所述探针Eliz-Pro的序列为SEQ ID NO：8所示；
检测摩氏摩根菌引物对和探针Mor-Pro，所述检测摩氏摩根菌引物对包括SEQ ID NO：5所示的上游引物Mor-F和SEQ ID NO：6所示的下游引物Mor-R，所述探针Mor-Pro的序列为SEQ ID NO：9所示。
2.根据权利要求1所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，其特征在于：所述上游引物Aer-ve-F、下游引物Aer-ve-R、探针Aer-ve-Pro、上游引物Eliz-F、下游引物Eliz-R、探针Eliz-Pro、上游引物Mor-F、下游引物Mor-R和探针Mor-Pro的终浓度为2mM到10mM。
3.根据权利要求1或2所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，其特征在于：所述探针Aer-ve-Pro、探针Eliz-Pro和探针Mor-Pro的5'标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX、CY5中的一种，且各个探针的5'标记的荧光基团互不相同；所述探针Aer-ve-Pro、探针Eliz-Pro和探针Mor-Pro的3'标记的淬灭基团为BQ1、BQ2中的一种。
4.根据权利要求1所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包括有酶液和反应缓冲液，所述酶液由DNA聚合酶组成，酶液和反应缓冲液直接采用市售的2XPremixExTaqMix。
5.一种权利要求1所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒的非诊断目的的检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)提取待测样本核酸，选用商品化的核酸提取试剂盒；
(2)配置扩增反应体系，体系为：17μLPCR扩增反应液，3μL待检核酸模，体系的总体积为20μL；
(3)荧光定量PCR扩增：将PCR管中配制好的扩增反应体系置于荧光定量PCR仪中进行扩增反应，并进行信号采集；
(4)结果判定：分别在相应通道查看扩增曲线在36个循环以内曲线良好的反应直接判定为阳性，36个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
6.根据权利要求5所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒的非诊断目的的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增反应液包含10μL的2XPremix ExTaqMix，各0.5μL权利要求1中所述的引物和探针，2.5μL的无菌水。
7.根据权利要求5所述的维氏菌、伊丽莎白菌和摩氏菌QPCR试剂盒的非诊断目的的检测方法，其特征在于所述扩增反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s后，60℃退火延伸30s并采集荧光信号40个循环。
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