[发明专利]一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法

权利要求书

1.一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

a 、卵母细胞培养：将采集到的卵母细胞复合体移入成熟液滴中，每滴成熟液微滴中移入10-20枚卵母细胞，在38-39℃、5% CO₂、饱和湿度环境下培养22-26h，卵母细胞复合体成熟为卵子；

b 、精液处理：取新鲜或者解冻后的精液，稀释成精子稀释液，在每个受精液滴中移入精子稀释液，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO₂培养箱中平衡2-3h；

c 、体外受精：将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中30-50个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38-39℃、5% CO₂、饱和湿度环境下培养箱中进行体外受精并培养18-24h；

d 、受精卵子培养：精子与卵子受精培养18-24h后，去除受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中进行体外培养6-8天；

其中，所述步骤d中的培养箱包括箱体（1）、箱体内放有多个培养皿（2）、用于多个培养皿单独升降的升降装置、控制箱体内温度和CO₂、O₂的控制装置、培养皿拿取或存放过程中与箱体隔绝的隔绝机构，所述升降装置包括等距环形分布固定设于箱体上的多个空心管（30）、与多个空心管内腔连通设置的空心盘（31）、位于空心管内的活塞杆（32）、固定设于活塞杆上端用于放培养皿的固定座（33）、位于空心盘轴心处且插入空心盘内的进气管（34）、设于空心盘上的吸气管（35）、设于空心盘内用于密封空心管的密封件（36）、设于密封件上的空腔（37）、用于密封件上空腔与进气管连通的连接管（38）、固定设于进气管上的大齿轮（39）、与大齿轮齿合设置的小齿轮（300）、用于驱动小齿轮转动的第一电机（310）；吸气管把空心盘和空心管内的空气吸出，位于空心管内的活塞杆下降最底端，固定座上的培养皿位于培养箱体内，取其中某一个培养皿，第一电机驱动小齿轮转动，带动大齿轮转动，所述大齿轮固定设于进气管上，从而带动进气管转动，进气管与密封件通过连接管连接，从而带动密封件以进气管为轴心转动，密封件位移需要取的培养皿正下方，即空心管正下方，该空心管通过密封件上的空腔和连接管与进气管连通，进气管注入气体，带动活塞杆和固定座及培养皿整体上升，完成培养皿的单个拿取；

所述步骤a中的成熟液在 M199 培养基原液中加入：8-12 g/mL促卵泡素、8-12 g/mL促黄体素、0.5-1.5 g/mL 雌激素、0.05-0.15mmol/L β - 巯基乙醇和10-20%发情母羊血清，培养液在使用前制作成 40-60μ L/滴的成熟液微滴；所述步骤c中的受精液在输卵管合成液中加入：0.1-0.2μmol/L青霉胺、0.1-0.2μmol/L亚牛磺酸、5-10μ g/mL 肝素和2 -10% 发情母羊血清;所述控制装置包括氧气管（40）、位于氧气管上方的湿气管（41）、位于湿气管上方的二氧化氮管（42）、等距环形分布设于氧气管上的多个出氧管（43）、等距环形分布设于湿气管上的多个出气管（44）、等距环形分布设于二氧化碳管上的多个出碳管（45）、分别插入多个出氧管内和出气管内及出碳管内的多个插杆（46）、位于多个插杆中间的转轴（47）、用于驱动转轴转动的驱动件（48）、贯穿固定设于转轴上的型腔轮（49）、转动设于插杆一端的滚珠（400）、用于混合氧气和二氧化碳及湿气的多个混气管（410）、分别设于混气管上方的多个挡气柱（420），型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状；驱动件驱动转轴不停的转动，所述型腔轮固定设于转轴上，从而带动型腔轮转动，所述型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状，多个插杆分别在出氧管和出气管及出碳管内移动，完成出氧管和出气管及出碳管的开启和关闭，不断的补充箱体内的氧气、二氧化碳和湿气，混气管对出来的氧气、二氧化碳和湿气进行混合再从混气管上端排出；

所述隔绝机构包括设于培养皿上方固定设于箱体内的第一隔板（50）和第二隔板（51）、位于多个固定座正上方且分别位于第一隔板和第二隔板上的多个型腔管（52）、设于第一隔板上的多个通孔（53）、设于型腔管上的排气管（54）、设于第二隔板上的溢气阀（55）、用于密封型腔管的密封盖（56）、固定设于型腔管上端呈弧状的环形凸块（57）、与环形凸块配合使用设于密封盖上的弧形圆槽（58）、用于密封盖翻盖的多组翻盖组件（59）；活塞杆上升，带动固定座和培养皿上升，固定座和培养皿上升至型腔管内，固定座与型腔管形成密封，固定座继续上升，位于型腔管内的气体通过排气管排出，固定座上升至排气管口处停止上升，固定座对排气管密封，翻盖组件驱动密封盖开启，培养皿位于箱体外便于拿取，放培养皿过程中，先驱动翻盖组件把密封盖盖住型腔管，活塞杆下降，带动固定座和培养皿下降，排气管开启，箱体内的气体进入型腔管中，活塞杆带动固定座和培养皿下降最低点后停止下降，培养皿位于培养箱内；

所述翻盖组件（59）包括固定设于密封盖上的第一固定板（591）、固定设于箱体上的第二固定板（592）、一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上的第一转杆（593）和第二转杆（594）、用于驱动第二转杆转动的第二电机（595）、固定设于箱体上的弧形导轨（596）、设于弧形导轨上的弧形滑块（597）、位于弧形导轨内用于弧形滑块归位的弹簧（598），所述弧形滑块与第二转杆固定连接；第二电机驱动第二转杆转动，以第二电机轴心转动，弧形滑块在弧形导轨上移动，密封盖跟着第二转杆转动，所述第一转杆一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上，第二转杆转动带动第一转杆转动，完成密封盖翻盖工作，第二电机停止工作，弹簧驱动弧形滑块归位，即第二转杆归位，最终驱动密封盖盖住型腔管。