[发明专利]一种木薯硝酸还原酶基因及其过量表达载体的构建和抗病应用

权利要求书

1.一种木薯硝酸还原酶编码基因，其CDS区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种木薯硝酸还原酶编码基因过量表达体系，其特征在于，包含在基因过量表达载体上插入木薯硝酸还原酶编码基因的CDS区得到的重组载体，所述CDS区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的木薯硝酸还原酶编码基因过量表达体系，其特征在于，所述的基因过量表达载体为pBI121载体。

4.一种pBI121介导的基因过量表达体系中的基因载体的构建方法，其特征在于，该方法的步骤如下：

(1)以权利要求1所述木薯硝酸还原酶编码基因的CDS区核苷酸序列作为基因过量表达体系的插入片段，根据pBI121载体序列，选用XbalI和SmaI酶切位点设计同源引物NR1-F和NR1-R；

(2)以华南124号木薯cDNA为模板进行PCR扩增，所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收目的片段，将目的片段连接到pEASY-Blunt3载体，得到pEASY-Blunt3-MeNR1，转化到大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基，培养后挑选单菌落进行PCR检测，将PCR检测后得到的阳性克隆菌液测序；

(3)测序比对正确后，提取所述pEASY-Blunt3-MeNR1后作为模板，使用步骤(1)设计的同源引物NR1-F和NR1-R扩增，得到的片段胶回收后，与经同样双酶切线性化的空载体pBI121混合后加入同源连接酶连接，转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于含有卡那 抗性的LB固体培养基，培养后挑选单菌落进行PCR检测，将PCR检测的得到的阳性克隆提取质粒，用XbalI和SmaI酶切验证，得到pBI121-MeNR1基因过量表达载体。

5.根据权利要求4所述pBI121介导的基因过量表达体系中的基因载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的NR1-F引物序列如SEQ ID No.2所示，所述的NR1-F和NR1-R引物序列如SEQ ID No.3所示。

6.权利要求4所述方法构建的pBI121-MeNR1基因过表达载体在木薯抗病害中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将转有pBI121-MeNR1基因过量表达载体的农杆菌菌液注射在木薯叶片背面。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的病害为木薯细菌性萎蔫病。