[发明专利]一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法

说明书

本发明公开了一种PDGFB基因启动子活性报告质粒的构建方法，提取正常小鼠外周血液，利用DNA抽提试剂盒提取小鼠基因组DNA，检测DNA纯度以及完整性后备用；数据库检索，得到小鼠PDGFB基因的启动子序列；PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3‑Basic‑vector，分别用Kpn I、Hind III双酶切；酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶16℃连接过夜；次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法。

背景技术

血小板衍生生长因子(PDGF)是目前已知最强的有丝分裂原，传统的PDGF家族包括PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD，PDGF具有强烈的促细胞的增殖、分化并导致肿瘤及肝纤维化等作用，其中PDGF-BB在肝纤维化过程中的作用尤为突出。PDGFB基因表达受很多因素调控，其中对其启动子活性的调控是最重要的调控方式。然而，目前并没有一个合适的研究PDGFB基因启动子活性的报告质粒。

发明内容

本发明提供一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，以解决现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，包括以下步骤：

S1、提取正常小鼠外周血液，利用血液DNA 抽提试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）提取小鼠基因组DNA，检测DNA 纯度以及完整性后备用；

S2、数据库检索，小鼠PDGFB基因的转录起始位点(TSS)区域长600bp(-499-100bp)的启动子序列；

S3、PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；KpnI如SEQ ID:NO:3所示，HindⅢ如SEQ ID:NO:4所示；

S4、扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）回收纯化；

S5、回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3-Basic-vector（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于pGL3-Basic-vector），分别用Kpn I、Hind III双酶切；

S6、酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；

S7、回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）16℃连接过夜；

S8、次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜；

S9、挑单克隆菌落于LB液体培养基扩大培养；

S10、质粒小量提取试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）提取质粒，至此质粒构建完成。

S11、质粒鉴定步骤：质粒通过经限制性核酸内切酶双酶切初步鉴定，并进一步送测序公司测序对所构建质粒序列进行，并命名为pPDGFB-luc。

进一步的，所述步骤S3中，引物Primer F（KpnI）的序列如SEQ ID:NO:5所示，引物Primer R（HindⅢ）的序列如SEQ ID:NO:6所示。

进一步的，所述步骤S8中，LB培养基中AMP 的含量为80mg/L。