[发明专利]一种基于双水相液滴微流控的3D类器官工程化方法

说明书

本发明提供了一种基于双水相液滴微流控的3D类器官工程化方法。该方法包括双水相水凝胶微囊的细胞负载、胰岛类器官工程化、肝类器官工程化等。本发明主要结合了新兴的人多能干细胞来源的3D类器官和液滴微流控技术，通过可控合成具有良好生物相容性、成分确定、大小均一的双水相水凝胶微囊，用于干细胞来源的3D类器官体外模型构建。本发明具有操作简单、可控性好、减小类器官的变异性、高通量产生等优点，为类器官在疾病模拟、药物筛选、体内移植等生物医学应用方面提供了一个强有力的新平台。

技术领域

本发明属于再生医学等领域，具体涉及一种基于双水相液滴微流控的3D类器官工程化方法。

背景技术

体外构建3D组织或器官模型可以模拟人体生理学，在生物医学应用中具有重要意义。近年来多种干细胞来源(包括成体干细胞、胚胎干细胞ESC以及诱导多能干细胞hiPSC)的类器官是一项重大技术突破，代表了一种新型的体外器官模型。类器官是干细胞在3D培养中进行特异分化并自组织形成的3D多细胞复杂结构，可以概括体内相应器官的关键结构和功能。目前已成功开发出多种类器官，如肠、脑、肝、肾、视网膜类器官，它们在组织器官发育研究、疾病模拟、药物筛选和转化医学应用等方面显示出巨大的潜力。尽管这类技术有潜在的优势和应用，仍然面临很多局限和不足。一般来说，类器官的产生主要依赖于干细胞包埋在动物来源的基质(如Matrigel)中进行自组织。然而，由于基质成分不确定性和批次间差异，这些传统方法产生的类器官往往具有明显的变异性，可控性差，产量较低等限制。结合现有的工程化手段如生物材料工程和微流控技术，有望优化类器官技术。

水凝胶材料作为细胞3D培养支架，已经在干细胞诱导分化和细胞共培养体系、类器官模型建立等方面得到了广泛的应用。然而，利用传统技术所得到的细胞3D培养水凝胶块，存在比表面积小，细胞营养物质交换不畅、材料尺寸及形貌可控性差等缺点，从而影响细胞或组织表型和功能。因此人们需要一种微观可控的水凝胶支架材料制备方法，而微流控的方法可以满足这些要求，开始在微型水凝胶(微凝胶)材料的合成方面得到应用。水凝胶微囊以其均匀的形态、良好的渗透性和可大量产生等优势，已被认为是组织工程中合适的3D细胞培养支架和移植载体。目前，合成水凝胶微囊主要依赖于微流控液滴技术，涉及到的水凝胶种类包括人工合成的聚乙二醇(PEG)类材料，天然的海藻酸盐、明胶、琼脂等。与传统油水体系不同，基于双水相体系的微流控液滴系统近年来快速发展起来。双水相体系利用的是聚合物的不相容性质，从而使两种不同聚合物的溶液在混合后可能自动分层，形成两相体系。该体系的两相溶液均为水溶液，具有更好的生物相容性，避免了传统的油包水乳液可能带来的细胞毒性风险。利用这些技术和材料制备的微囊在细胞3D培养、干细胞诱导分化以及体外组织或器官构建方面存在很大的应用价值。结合水凝胶材料和微流控液滴技术可以更好地控制组织形态大小均一，有利于高通量产生3D微组织。但是目前将双水相微流控液滴技术用于类器官工程化，优化体外类器官的形成及操作尚属空白。

发明内容

本发明的目的在于开发一种新型的双水相液滴微流控系统，用于一步制备水凝胶微囊，致力于3D类器官工程化。所建立的液滴微流控系统包含不同的功能单元：多相流体入口、液滴生成和微囊产生单元。该系统通过可控形成均一大小的水凝胶微囊，不仅可以用于细胞包封、3D培养、分化和类器官形成，还有利于减小类器官的可变性，并具有易操作、生物兼容性好、高通量、高可控性的特点。为多种类器官工程化以及类器官模型在疾病研究、药物筛选、移植治疗等方面提供了一个新的策略和技术平台。

本发明提供了一种基于双水相液滴微流控的3D类器官工程化方法，该方法结合人多能干细胞来源的3D类器官和液滴微流控技术，通过可控合成具有良好生物相容性、成分确定、大小均一的双水相水凝胶微囊，用于干细胞来源的3D类器官体外模型构建；包括下列步骤：

步骤一、采用双水相液滴微流控芯片，生成双水相水凝胶微囊并完成细胞负载；

步骤二、3D类器官工程化：人多能干细胞汇集到一定生长密度时，将培养干细胞的商业化mTESR1培养基替换为内胚层分化培养基，静置培养，之后诱导组织前体细胞分化，最终产生3D类器官。