[发明专利]苹果树腐烂菌LAMP扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒

说明书

本发明公开了苹果树腐烂病菌LAMP扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒。所公开的引物是针对苹果树腐烂病菌属保守的EF‑1a基因，优选了目的基因片段来设计特异性引物，使得该引物能有效检测苹果树腐烂病菌属，而且特异性好。所公开的试剂盒包括研磨液管、RNA酶液管、核酸提取液A管、核酸提取液B管、核酸提取液C管、LAMP反应液管、Bst DNA聚合酶管、显色剂管、阳性对照核酸管、阴性对照管和矿物油管。本发明的试剂盒及相应检测方法不仅实现了苹果树腐烂病菌的通用检测，而且成本低、灵敏性高、操作简单，同时可实现现场快速检测。

技术领域

本发明属于植物病菌检测技术领域，具体涉及一种苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的检测方法及所用的核酸等温扩增检测试剂盒。

背景技术

苹果是闻名世界的四大水果之一，也是我国出口创汇较多水果品种之一。由于苹果生态适应性强、营养价值高、供应周期长等优点，已经被世界上众多的国家列为其主要的消费果品。我国苹果栽培面积、总产量、人均占有量与出口量均居世界第一，是全球最大的苹果生产和消费国。2016年全国苹果种植面积为246.69万公顷，总产量为4388万吨，苹果产业已经成为我国北方农村经济发展的重要支柱产业，其发展对于我国经济和农民的增收起至关重要作用。然而，由于黑腐皮壳属真菌Valsa mali导致的苹果树腐烂病一直威胁我国苹果产业的安全。该病不仅造成苹果产量和品质的下降，也是造成树死和园毁的主要原因。同时，我国目前每年约有10％的苹果树需要更新换代，苹果树种苗中携带腐烂病菌时有发生。因此，开发苹果树腐烂病菌早期快速检测技术，为田间精准防治及阻断带菌种苗的传播提供技术支持，从而避免因苹果腐烂病导致的死树、减产等生产问题。

随着分子生物学技术的不断发展，应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多，但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处。如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性；PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR(Nest-PCR)和实时荧光定量PCR等，PCR技术检测时间较长，需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备，对于承担大量检测任务的植物检疫部门和条件简陋的基层农技部门来说，这些分子检测方法的实用性受到限制。因此，在生产中，亟需开发一些新型的、快速、简便、可靠且低成本的检测手段。

发明内容

针对现有技术存在的问题或缺陷，本发明的目的之一是提供一种苹果树腐烂病菌LAMP扩增引物。

基于此，本发明提供的苹果树腐烂病菌LAMP扩增引物有正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物Loop F和反向环引物Loop B组成，各引物序列如下：

进一步，本发明还提供了一种苹果树腐烂病菌检测用试剂盒。

本发明所提供的苹果树腐烂病菌检测用试剂盒内装有：研磨液管：内装研磨液；RNA酶液管：内装RNase溶液；核酸提取液A管：内装乙酸钠溶液；核酸提取液B管：内装异丙醇溶液；核酸提取液C管：内装乙醇溶液；LAMP反应液管：内装内装含有本发明所述引物的LAMP反应液；Bst DNA聚合酶管：内装Bst DNA聚合酶；显色剂管：内装核酸染料SYBR Green I；阳性对照核酸管：内装苹果树腐烂病菌阳性DNA；阴性对照管：内装无菌水和矿物油管：内装矿物油。

优选的，本发明研磨液的组分包括Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS和PVP。更优选的，各组分浓度为Tris-HCl：100mM，NaCl：1M,EDTA：50mM，SDS的质量百分比浓度为2％，PVP的质量百分比浓度为2％；研磨液的pH为8.5。

优选的，本发明的LAMP反应液包括权利要求1所述引物组合物、dNTPs、betaine、Tris-HCl、KCl、(NH4)₂SO₄、MgSO₄和Tween-20。