[发明专利]一种CEBPA基因的探针设计方法及其应用

说明书

本发明公开了一种CEBPA基因的探针设计方法及其应用，针对CEBPA基因的编码序列，按照序列反向互补的原则，以rs762459325位点为中心向两侧每隔20bp平铺设计长度为120bp的探针序列；并结合cosmic数据库，对以上得到的探针序列进行优化得到优选的探针序列。同时公开了由该探针序列构建的DNA探针文库以及用于CEBPA基因突变的检测试剂，并公开了CEBPA基因突变的检测方法。本申请对CEBPA基因突变的检测具有较高的灵敏度和检出率，能够达到国际报道水平，其对血液肿瘤患者疾病诊断提供了一种可靠的途径，具有一定的市场推广经济价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CEBPA基因的探针设计方法及其应用。

背景技术

CEBPA基因突变在急性髓系白血病(AML)中发生率约为10-15％(PMID:21177436)。2017年欧洲血液病网络(ELN)、2019年美国国立综合癌症网络(NCCN)、成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2017年版，中华血液学杂志,2017,38(3):177-182)AML预后分层指南提示：CEBPA双突变AML患者采用化疗治疗预后较好属于低危组。此外，2016世界卫生组织(WHO)新增髓系肿瘤伴胚系易感基因变异亚型，CEBPA胚系易感基因变异属于其中之一。因此，CEBPA双突变检测在血液肿瘤精准医疗中具有重要的临床应用意义。

CEBPA基因位于染色体19q13.11，该基因仅有1个外显子，开放阅读框全长1077bp，GC含量高达74.7％。CEBPA基因主要分为三个区域，分别是TAD1区、TAD2区和bZIP区，其突变主要发生在靠近N端的TAD1区和C端的bZIP区。当前国内外CEBPA基因突变主要检测方法仍然以一代sanger测序为主，即以脱氧核糖核酸(DNA)为检测对象，采用PCR结合一代测序的方法检测(《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识(2018)版》解读，临床血液学杂志，2019年32卷5期，341-347)，用于检测CEBPA基因突变的引物及检测方法(公布号：CN107841538A)，一种检测人类基因CEBPA的PCR引物及检测方法(公布号：CN108220411A)。一代测序检测CEBPA的局限性在于检测灵敏度不高，仅10-20％左右。随着高通量测序技术的发展，2018年Ng CWS等人公开了高通量测序检测CEBPA突变的方法，该方法首先利用PCR扩增的方法把CEBPA基因进行扩增，扩增后产物使用Miseq测序仪进行检测，该技术能够很好的检测CEBPA基因rs762459325单核苷酸多态性(c.584_589dupACCCGC/p.His195_Pro196dup)(PMID:29180507)。但是该文献没有公布CEBPA扩增引物序列。并且由于CEBPA基因GC含量较高，同时该技术方法也仅能够检测CEBPA一个基因。随着血液肿瘤精准医疗的不断发展，血液肿瘤患者需要进行突变检测的基因也越来越多(中华血液学杂志,2017,38(3):177-182))。二代测序根据测序原理分为扩增子建库和探针捕获建库。由于CEBPA基因GC含量较高，当该基因同其它基因同时扩增和检测，往往由于GC含量较高扩增效率低导致最终测序结果中CEBPA基因的测序深度不是很好，需要单的扩增。探针捕获法的优势在于对高GC含量区域有比较好的捕获效率，可以同其它基因探针放在一个反应体系中进行捕获和后续测序。但是，目前没有其它文献公开CEBPA基因探针设计方法和探针序列，并且也没有利用探针捕获方法对CEBPA基因rs762459325单核苷酸多态性检测进行性能确认。

发明内容

本发明的目的是建立一种CEBPA基因探针设计方法，该方法以DNA为样本来源，通过本发明设计的探针序列，能够有效捕获CEPBA基因正常和突变序列，通过高通量测序的方法进行检测。本发明设计的探针同时能够很好的捕获CEBPA基因单核苷酸多态性rs762459325，并且当患者在rs762459325附近发生突变时候也能够检测。同时，本发明设计的探针能够和其它基因探针放在一起使用，即通过一个反应就能同时检测CEBPA基因突变和其它基因突变的情况，具有很高的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：