[发明专利]一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株，其特征在于：用卡那霉素抗性基因替换猪种布鲁氏菌BI-1基因获得；

所述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1) 根据猪种布鲁氏菌基因组序列和pEGFP-C1基因序列以及pUC18质粒的酶切位点信息，设计所需PCR引物；

(2) 以布鲁氏菌S2疫苗株基因组为模板，PCR扩增获得BI-1上、下游同源臂BI1-UP和BI1-DW；以pEGFP-C1质粒为模板，PCR扩增获得卡那霉素抗性基因KanR；

(3) 将步骤（2）得到的基因片段分别与pMD19T-simple载体连接，获得相应的重组质粒pMD19T-BI1-UP、pMD19T-BI1-DW和pMD19T-KanR；

(4) 将步骤（3）得到的重组质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行培养，提取相应重组质粒，送生物公司测序；

(5) 将步骤（4）测序正确的重组质粒分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，回收纯化BI-1上、下游同源臂基因片段和KanR基因片段；

(6) 将步骤（5）得到的基因片段等体积混合后与pUC18载体进行连接，获得同源重组缺失质粒pUC18-BI1-KanR；

(7) 制备猪种布鲁氏菌感受态细胞备用；

(8) 将步骤（6）得到的同源重组缺失质粒与步骤（7）所得的感受态细胞混匀，冰置10min，转移到预冷的1 mm电击杯内，以2.5KV、4.5 ms的条件进行电转化，立即加入1 mL无抗TSB液体培养基，37 ℃、180 rpm复苏12 h，然后涂布含25 μg/mL卡那霉素的TSA固体培养基，置于37 ℃培养72 h，挑取单克隆菌落进行培养；

(9) 将步骤（8）中得到的菌液置于70 ℃水浴灭活2 h，然后用鉴定引物BI1-TF/TR进行PCR鉴定，筛选出BI-1基因缺失菌株；

所述引物包括：

。

2.根据权利要求1所述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，制备猪种布鲁氏菌感受态细胞包括：将冻存于-80 ℃的猪种布鲁氏菌S2疫苗株于无抗性的TSA固体培养基上划线复苏，挑取单菌落接种于10 mL无抗性TSB液体培养基中，37 ℃、180rpm培养48 h，然后按照体积比1:100接种于50 mL无抗性TSB液体培养基中扩大培养；当OD6₀₀=0.9时，将菌液置于冰上预冷30 min，然后4500 g离心20 min，弃上清；用20 mL 预冷的ddH₂O重悬菌体，4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；然后用20 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，4500 g离心15 min，弃上清，重复1次；最后用1 mL预冷的10%甘油水溶液重悬菌体，以100 μL的体积分装， -80 ℃冻存备用。

3.一种如权利要求1所述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株在制备布鲁氏菌减毒活疫苗中的应用。

4.一种如权利要求1所述的猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株在制备用于检测布鲁氏菌感染动物的检测试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述猪种布鲁氏菌BI-1基因缺失菌株在制备用于检测布鲁氏菌感染动物的检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括BI-1抗体检测试剂。