[发明专利]一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于宏基因组学的病原微生物检测方法，所述方法为非疾病的诊断方法，所述方法包括如下步骤：

核酸提取；

高通量测序文库构建；

测序文库定量：将高通量测序文库构建步骤中构建的测序文库进行定量；

高通量测序：将测序文库定量步骤中定量后的测序文库，稀释至1-4pM，在测序仪上进行高通量测序；

结果分析：对高通量测序中获得的测序数据进行分析；

所述高通量测序文库构建方法包括步骤：

S101，使用含片段化酶的反应体系将DNA序列片段化，并将片段化后的DNA片段进行末端修复；

S102，使用连接酶反应体系，将高通量测序所需的接头序列连接在S101中获得的DNA片段两端，所述接头序列上带有特异的标签序列；

S103，对S102中的产物进行纯化，获得高通量测序文库；

所述结果分析步骤的分析方法包括步骤：

S401，将样本测序数据进行拆分，

S402，计算数据中的宿主序列比例，

S403，去除宿主序列，

S404，将剩余序列与病原数据库进行比对，具体方法包括步骤：

S501，生成数据库哈希索引，基于特定序列长度s对数据库包含的碱基序列进行拆分，以碱基序列作为哈希索引，存储碱基序列所在基因组位置列表信息；

S502，序列局部比对，将查询序列拆分为同样长度的碱基片段，通过哈希碰撞在哈希索引中查找对应序列，并获取该片段在基因组中的位置信息；

S503，计算测序序列在参考序列不同位置的编辑距离，查找最佳比对结果；

S504，统计比对结果并输出，根据序列差异计算测序序列与数据库参考序列之间的距离，若最佳比对结果编辑距离为m，根据预设的编辑距离范围n，查找编辑距离最小为m，最大为n的比对结果，并将结果输出；

其中，步骤S101中，其反应体系包括：按体积份数计，DNA样本X份，片段化缓冲液1-2份，片段化酶2-4份，Buffer EB将体系补足至15份，其中，所述DNA样本浓度为5-30ng/μl，X＜12，

反应条件为：

所述片段化酶反应体系还包括聚乙二醇2000，按体积份数计，所述聚乙二醇2000的含量为0.1-0.3份，所述片段化酶反应体系中还包括0.02-0.04份的聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)。

2.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述步骤S102中，其反应体系包括，按体积份数计：

末端修复产物10-20份，连接缓冲液5-8份，连接酶2-5份，带有标签序列的接头4-6份，Buffer EB 0.5-2份，其中，所述连接酶浓度为500-800U/μl，

反应条件为，

3.根据权利要求1-2任一种所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：步骤S103中，对步骤S102中的产物通过磁珠进行纯化，所述通过磁珠进行纯化的步骤包括：

S201，吸取10-30μL Buffer EB 和30-50μL DNA Clean Beads至20-40μL接头连接反应产物中，充分混匀；

S202，室温孵育1-10min；

S203，离心后，在外部磁场的作用下分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；

S204，继续在外部磁场的作用下，加入100-300μL的70-90％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育10-60s，移除上清；

S205，将所述磁珠暴露在空气中干燥5-10min；

S206，将磁珠加入10-30μL EB洗脱，充分混匀，室温下静置1-10min，离心并置于外部磁场下静置，待溶液澄清后，吸取10-20μl上清液，即为纯化产物。

4.根据权利要求3所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述S204中，所述乙醇溶液中，含有0.02-0.05mol/L的氯化钾。

5.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的病原微生物检测方法，其特征在于：所述将样本测序数据进行拆分的方法为，每一个文库两端所连接的接头上都有一个特异的标签序列，数据下机后，会根据每一条序列上测得的标签序列将不同的reads分配至不同的文库下。