[发明专利]一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法

说明书

本发明公开了一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，包括尿液酶解、过柱和萃取、洗脱、浓缩、Ames试验微量波动法和结果判定共六个步骤，其中尿液酶解采用乙酸钠‑乙酸缓冲液调节控制pH环境，过柱时依次用甲醇和水预处理，并在去离子水冲洗后用甲醇洗脱，经浓缩后采用Ames试验微量波动法检测并判定结果，该方法可以显著降低传统Ames试验所需的尿液检测量，并提高检测灵敏度，尤其适用于大鼠烟气暴露模型的生物学检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法。

背景技术

卷烟烟气是含有6000多种化合物的复杂气溶胶，其中有69种被IARC确定为人类致癌物。卷烟烟气中的多环芳烃、各种烷化剂、苯系物、芳香胺等致突变物质，这些物质进入人体或实验动物体内后，经体内代谢，多以原型、代谢产物或是结合物等形式从肾脏排出，因此采用短期的致突变试验检测尿液的诱变作用具有重要的意义。

人群烟气暴露存在很大的差异性，因此以Sprague Dawley大鼠作为试验对象，检测烟气暴露不同周期后大鼠尿液的致突变性，可直接反应烟气吸入暴露的致突变作用。但由于目前的现有技术中，尿液致突变试验的尿液前处理方法，尿液需要量在50~100 mL以上或更多的，因此，现有方法仅适用于人体尿液的致突变检测，而大鼠尿液量极少，采用现有方法无法有效评价其致突变性。

Ames等人曾采用鼠伤寒沙门氏菌在微粒体酶系统存在时，以传统平板掺入法检测尿液的致突变性，由于该方法每平皿的受试物限制为0.1 mL，而且尿液中的组氨酸也可干扰实验结果，因此该传统方法只能检测高浓度的致突变物，对致突变物质的浓度较低的尿液无法适用。

发明内容

本发明的目的在于建立一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，采用酶解、过柱、萃取、浓缩等方法来处理尿液，使尿液检测量至少降低10倍，并且研究建立了尿液酶解浓缩后的Ames试验微量波动法，提高了检测的灵敏度，可作为烟气暴露的生物学检测指标。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种大鼠烟气吸入暴露后尿液的致突变检测方法，包括以下步骤：

S1.尿液酶解

将预先收集的尿样解冻至室温，取5 mL于玻璃瓶中，依次加入8~15mL 乙酸钠-乙酸缓冲液和50 µL β-葡萄糖醛酸酶，混合均匀后放入恒温水浴槽中，在37 ℃下避光酶解14~20 h；

S2.过柱和萃取

称取XAD-2吸附剂1.05±0.05 g，置入层析柱内，首先用甲醇5~10mL浸润萃取，近流完时，加入5~10mL水来进行预处理，近流完时，加入酶解的尿样；

S3.洗脱

加入去离子水5~8 mL冲洗层析柱，洗去尿液中存在的组氨酸，弃去冲洗液，随后加入10 ~15mL甲醇于层析柱，洗脱XAD-2吸附剂上的尿液物质；

S4.浓缩

洗脱液放入氮吹仪，直至吹干，加入100 μL的二甲基亚砜（DMSO）萃取残留物；

S5.Ames试验微量波动法

鼠伤寒沙门氏菌TA98过夜培养后，将菌液稀释至1~2×10⁸个/mL。将0.1 mL菌液、8.85 mL选择指示生长培养基、0.1 mL尿液DMSO萃取液、0.25 mL的3.2mg%组氨酸、0.25 mL的0.8 mg%生物素、1.15mL的10%S9混匀，以0.2 mL/孔加入96孔细胞培养板，48孔/板，37℃培养48 h，溶剂对照为DMSO，阳性对照为环磷酰胺；

S6.结果判定