[发明专利]三维宽视场和高分辨层析成像方法及装置

说明书

本发明公开了一种三维宽视场和高分辨层析成像方法及装置，其中，该方法包括：在数字微镜器件上分别加载结构图案和平面图案，通过光源照射数字微镜器件依次产生结构光和均匀光并中继到样品上，收集激发出的结构光照明图像和均匀光照明图像；结构光和均匀光照明图像经过反射分束器件后被分为多个子视场图像；将多个子视场图像进行拼接得到宽视场结构光照明图像和宽视场均匀光照明图像；利用结构光层析算法将拼接后的宽视场结构光照明图像和宽视场均匀光照明图像进行结合得到宽视场光学层析图像；对样品进行轴向扫描成像，并将所得的宽视场光学层析图像进行数据重建，得到高分辨、宽视场的三维层析图像。该方法可以用于生物动态过程的三维快速成像。

技术领域

本发明涉及光学显微技术领域，特别涉及一种三维宽视场和高分辨层析成像方法及装置。

背景技术

当前，光学显微成像在生物医学研究、临床疾病诊断等领域有着广泛地应用。考虑到生物活体样本通常具有三维立体的结构，为了对生物动态过程进行深入研究，常常需要对其进行快速三维宽视场、高分辨层析成像。宽场荧光显微镜由于具有视场大、成像速度快等优点而被广泛应用。然而，传统的宽场荧光显微镜存在以下问题：

1)传统宽场荧光显微镜的轴向非定域激发特性使得其不具有光学层析能力，无法对生物样本进行三维立体成像。为了解决这个问题，人们提出了激光扫描共聚焦显微、双光子荧光显微等技术，获得了轴向光学层析能力。但是由于上述成像技术依赖于扫描成像，显微系统结构复杂，成像速度慢，难以满足实际需求。

2)根据瑞利判据，在衍射受限的情况下，显微镜的光学分辨率可以通过

来计算，其中，λ_ex代表发射荧光的波长，NA代表物镜的数值孔径。由式(1)可以看出，在发射波长确定的情况下，物镜的数值孔径越大，显微系统的光学分辨率越高。因此，宽场荧光显微镜常常配备高数值孔径的物镜以获取高的光学分辨率。然而，宽场荧光显微镜的最终分辨率不仅仅取决于物镜的光学分辨率，还取决于相机的采样频率。根据奈奎斯特采样定理，只有在采样频率大于等于信号最高频率的2倍时，采样之后的数字信号才能完整地保留原始信号中的信息。因此，只有在满足：

(pixel size为相机像素的尺寸，magnification为成像系统的光学放大率)的情况下，显微系统的最终分辨率才是衍射受限的。在发射光波长、物镜NA、相机像素尺寸确定的情况下，可以通过增大显微系统的光学放大率来满足(2)式。然而，根据相机的成像视场的计算公式：

(pixel number为像素个数，pixel size为像素尺寸，magnification为光学系统放大率)，增大显微系统的光学放大率会缩小相机视场。因此，在实际使用宽场显微镜的过程中，人们往往通过牺牲宽视场来满足奈奎斯特采样定理从而实现高分辨，或通过亚采样以牺牲高分辨为代价实现宽视场成像，高分辨和宽视场难以同时被满足。

要发展三维宽视场、高分辨层析成像方法，首先要解决传统宽场荧光显微镜缺失轴向层析能力的问题。采用正弦周期结构光照明(Structure Illumination Microscopy，SIM)的方法可获取光学层析图像。在这种方法中，为了获取一幅光学层析图像，需要拍摄三幅结构条纹照明的图像，每幅图像之间的条纹间隔为三分之一个条纹周期。然而，样本的移动对这种方法干扰很大。为了解决这个问题，可采用“HiLo”的结构光层析方法。在这种方法中，获取一幅层析图像只需要拍摄两幅图像，其中一幅是结构光照明的图像，另外一幅是均匀光照明的图像，将两幅图像结合起来可以计算恢复出层析图像。

对于三维成像，常规方法需要通过轴向移动物镜或生物样本来实现。受到机械元件固有惯性的限制，上述方法的成像速度慢，难以用于实时观察三维生物动态过程。