[发明专利]一种基于LAMP可视化检测玫烟色棒束孢的引物和检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种基于LAMP可视化检测玫烟色棒束孢的引物和检测方法及应用，属于虫生真菌技术领域，所述引物包括F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物；所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。采用本发明的引物结合检测方法能够实现对玫烟色棒束孢的可视化检测，引物特异性强，灵敏度高，样品DNA含量10fg以上即可检测出。

技术领域

本发明属于虫生真菌诊断技术领域，尤其涉及一种基于LAMP可视化检测玫烟色棒束孢的引物和检测方法及应用。

背景技术

近年来，我国对农业有害生物的生物防治给以了极大的重视。但目前关于生防菌的基础研究比较薄弱，特别是对靶标害虫的病原性真菌的流行病研究还缺乏有效合理的技术手段，这严重阻碍了生防菌的利用和发展。

玫烟色棒束孢(Isariafumosorosea，Wize)属于半知菌纲，壳霉目、杯霉科。其地理分布广泛，昆虫寄主多样，是蚜虫、粉虱等重要害虫的致病真菌。在自然条件下，可在蔬菜、水果和园林植物等害虫种群中形成流行病。如在我国南方地区蔬菜烟粉虱种群中，可大面积地持续流行、有效地控制烟粉虱为害。然而，关于该生防菌对靶标害虫的流行病学研究还是空白。由于室外环境复杂，微生物种类多，干扰因素多，目前传统的形态鉴别与现代的PCR分子检测方法，费时费力，对设备要求高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于LAMP可视化检测玫烟色棒束孢的引物和检测方法及应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种基于LAMP可视化检测玫烟色棒束孢的引物，所述引物包括F3引物、B3引物、FIP引物和BIP引物；

所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供了一种利用上述技术方案所述的引物可视化检测玫烟色棒束孢的方法，包括：提取样品的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物进行LAMP反应，得到LAMP产物；

当所述LAMP产物为绿色时，所述样品中含有玫烟色棒束孢；

当所述LAMP产物为橘黄色时，所述样品中不含有玫烟色棒束孢；

所述LAMP反应使用的体系中含有钙黄绿素和MnCl₂。

优选的，所述LAMP反应使用的体系，每25μl包括：浓度为5μM的F3引物1μl、浓度为5μM的B3引物1μl、浓度为10μM的FIP引物4μl、浓度为10μM的BIP引物4μl、10×ThermopolBuffer 2.5μl、浓度为10mM的dNPTs 1μl、浓度为0.8M的Betaine 5μl、浓度为10mM的MgSO₄溶液1μl、浓度为50μM的钙黄绿素1μl、250μM的MnCl₂溶液1μl、酶活为8U的Bst DNA聚合酶1μl、浓度为10ng/μl的样品基因组DNA 2μl，ddH₂O补足到25μl。

优选的，所述钙黄绿素与MnCl₂的体积比为1:5。

优选的，所述LAMP反应的条件包括：将所述LAMP反应使用的体系95℃变性5min，立即插到冰上，再65℃保持40min，再80℃保持2min。