[发明专利]一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法

说明书

本发明公开了一种监测pre‑mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A‑B‑C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon 1、Intron、exon 2组成，所述的片段C为Rluc。所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。通过对本发明的报告基因分子影像探两种荧光素酶产生的信号比值Fluc/Rluc进行分析，实时、无创地分析在体pre‑mRNA的剪接效率，为调控pre‑mRNA剪接的药物研究提供了有效的筛选工具。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种监测pre-mRNA的双报告基因影像探针及制备方法。

背景技术

Pre-mRNA剪接过程的化学本质包含两步转酯反应。该化学反应在细胞中难以自行发生，需要剪接体的参与完成。剪接体是指进行Pre-mRNA剪接时形成的多组分复合物，主要是由小分子的核RNA和蛋白质组成。它是在剪接过程的各个阶段随着SNRNA的加入而形成的。也就是说在完整的pre-mRNA上形成的一个剪接中间体。剪接体本身需要一些小核RNA参与。这些小核RNA不会翻译出任何蛋白，但对于调控遗传活动起到重要作用。因为许多人类疾病都可以归咎于基因的错误剪接或针对剪接体的调控错误。据知人类35％的遗传紊乱是由于基因突变导致单个基因的可变剪接引起的。还有一些疾病的起因是剪接体蛋白的突变影响了许多转录本的剪接。还有一些癌症也与剪接因子的错误调控有关。

现在研究者们通过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱、建立体外剪接反应系统等研究手段，初步建立起剪接体的组装、激活与解聚的发生过程，以及蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的相互作用、相互调控等复杂的RNA剪接调控网络。但由于剪接体高度的动态性和复杂性，一直以来缺乏可靠的系统来检测剪接效率。因此本发明开发了一种双荧光素酶报告基因影像探针，实时监测pre-mRNA剪接效率，为研究pre-mRNA的剪接提供稳健、快速和方便的检测工具。

本发明运用分子影像手段，开发了基于双荧光素酶报告基因的显像系统定量分析pre-mRNA的剪接效率。为实时、快速、定量的研究剪接效率提供了检测工具。通过载体报告基因系统在活体中的稳定表达，无创、重复的提供活体实时、动态、可视化的分子剪接信息，同时进行定量研究，将其中的两种荧光信号进行分析，可实时评估剪接体在体内的剪接过程及剪接效能，检测体内基因表达情况。对剪接相关的基因进行成像，对于优化基因治疗方案和评估疗效起着关键作用。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法，根据两种荧光素酶所产生的荧光强度，监测剪接过程的发生发展及剪接效率。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针，所述的探针包括载体pcDNA3.1、基因片段A、B、C，所述的基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组，所述的片段A为Fluc，所述的片段B由exon 1、Intron、exon 2组成，所述的片段C为Rluc。

所述的片段A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的片段B的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述的片段C的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的另一方面，提供了一种监测pre-mRNA剪接效率的双报告基因探针及制备方法，包括以下步骤：

1)用KpnI和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；

2)PCR扩增A、B、C片段；

3)基因片段A、B、C按照A-B-C顺序与线性化的pcDNA3.1载体重组；