[发明专利]一种基于DNA条形码(ITS2)鉴定中药小叶榕的方法及其应用

说明书

本发明公开一种基于DNA条形码(ITS2)鉴定中药小叶榕的方法，其特征在于，所述鉴定中药小叶榕的DNA条形码基因序列为ITS2(第二个核糖体RNA内转录间隔区)。本发明基于DNA条形码鉴定中药小叶榕的方法包括下列步骤：样品采集，DNA提取(TIANGEN试剂盒法)，PCR扩增引物和筛选，PCR反应，测序。该DNA条形码序列可以作为中药小叶榕鉴定的标准序列，可以高效、精准地鉴定中药小叶榕原料。

技术领域

本发明涉及生物技术鉴定方法，具体涉及植物物种的生物技术鉴定方法，尤其涉及一种基于DNA条形码鉴定中药小叶榕的方法及其应用。

背景技术

中药小叶榕(Ficus microcarpa L.f.)为桑科(Moraceae)榕属(Ficus Linn)乔木，主要分布于广东省、广西自治区、贵州省、云南省和台湾省。通常生于海拔900-1600米密林中或村寨附近。锡金、不丹、印度、中南半岛各国，马来西亚、菲律宾、北加里曼丹也有，是名优中成药咳特灵的主要成分。然而，市场上对小叶榕的鉴定和质量管理尚不完善。因此，为保障药材原料的安全，提高小叶榕质量管理规范，建立一种对中药小叶榕准确、有效地鉴定的方法是极其有必要的。

植物DNA条形码分子鉴定技术是基于DNA条形码(基因组中一段公认的、相对较短的 DNA序列)来进行特种鉴定的一种分子生物学技术。它是传统的形态学鉴定方法的补充，能够在植物形态不完整或缺乏形态结构(如粉末)时对植物进行精准和有效地鉴定。由于其具有进化速率快、易扩增的特点，核糖体中的ITS2(第二个核糖体RNA内转录间隔区)已经被推荐为首先的植物DNA条形码序列，它们能够在特种水平上对植物进行有效、精准的鉴定《植物DNA条形码技术》(任保青等,2010)。

药材原料的准确的鉴定是安全生产、药品安全和消费者权益保障的基础。已有研究表明， ITS2序列在种级水平上鉴定植物的分辨率可达到92％以上，(Chen S,Yao H,HanJ,ct al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifyingmedicinal plant species[J].PloS one,2010,5(1):e8613；Ren B,Xiang X,ChenZ.Species identification of Alnus(Betulaceae)using nrDNA and cpDNA geneticmarkers[J].Molecular Ecology Resources,2010,10(4):594-605.)。因此，ITS2能够有效、准确地对植物物种进行鉴定，可将ITS2序列作为中药小叶榕DNA条形码的标准序列。

在实际的生产中，本发明人在采购中药小叶榕原料时，经常遇到的问题是无法保证原料的完整性，这给原料的形态学鉴定带来了较大的困难。因此，探寻更科学、准确的鉴定方法是首要任务。以ITS2序列作为中药小叶榕鉴定的标准序列，目前尚未见到相关的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计采用生物技术鉴定中药小叶榕的方法。

本发明提供一种基于DNA条形码鉴定中药小叶榕的方法。

本发明所采用的技术方案是：

所述鉴定中药小叶榕的DNA条形码基因序列为ITS2(the secondinternaltranscribed spacer，第二个核糖体RNA内转录间隔区)，所述鉴定中药小叶榕的DNA条形码序列ITS2可以应用于鉴定小叶榕。

具体的，本发明基于DNA条形码鉴定中药小叶榕的方法包括下列步骤：

(一)DNA的提取

(1)样品采集：采集小叶榕新健康鲜嫩叶若干，用酒精轻轻擦拭叶片表面，晾干备用。

(2)DNA提取(TIANGEN试剂盒法)：