[发明专利]一种紫菜功能基因过表达质粒的构建方法和应用

说明书

本发明属于海洋生物领域，具体地说涉及一种紫菜功能基因过表达质粒的构建方法和应用。构建方法：利用引物对扩增条斑紫菜光系统I捕光天线蛋白LHCI基因的CDS序列，而后将其连接至质粒PEA7上，即获得条斑紫菜功能基因过表达质粒；本发明方法高效，成功率高，易于筛选。是研究紫菜功能基因作用机制的重要方法，为紫菜关键基因功能的分子生物学研究提供了一种有效途径。

技术领域

本发明属于海洋生物领域，具体地说涉及一种紫菜功能基因过表达质粒的构建方法和应用。

背景技术

紫菜口味鲜美，营养丰富，是我国也是世界上重要的经济红藻，具有很高的营养价值和经济价值。其中条斑紫菜在我国江苏省和山东省等地广泛栽培，从业人员众多，行业总产值巨大(每年约20亿元)。此外，作为潮间带的代表性大型海藻，条斑紫菜在进化上占据重要地位，是研究藻类及植物进化过程的模式材料。

2013年条斑紫菜的基因组信息由日本科学家测序完成。自此，条斑紫菜进入了分子生物学研究的新时期。虽然基因工程相关技术研究在高等植物中已十分成熟，但在大型经济藻类中却相对匮乏。条斑紫菜关键基因的功能研究由于缺乏有效的分子生物学手段而进展缓慢。如何利用基因工程的手段调控紫菜关键代谢通路中的关键基因表达成为亟待解决的问题。通过体内表达目的基因，使其上调表达是研究特定基因功能的有效途径。近年来，日本科学家通过转基因的方法成功在条斑紫菜中表达了包括GUS和CFP在内的多个报告基因，但却没有报道条斑紫菜功能基因成功表达实例。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫菜功能基因过表达质粒的构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种紫菜功能基因过表达质粒的构建方法，利用引物对扩增条斑紫菜光系统I捕光天线蛋白LHCI基因的CDS序列，而后将其连接至质粒PEA7上，即获得条斑紫菜功能基因过表达质粒；

引物对：F:agcaagcccggatccatgttgg gctttgcgtcg，R：agatctgagtccggactagtggtggtggtggtggtgcgggaagagcttgccg。

所述条斑紫菜光系统I捕光天线蛋白LHCI基因的CDS序列插入质粒PEA7的启动子和终止子之间，并在终止子前加入6个组氨酸密码子gtg作为蛋白表达验证标签。

进一步的说

1)提取条斑紫菜总RNA，反转成cDNA；

2)以上述cDNA为模板，用引物对扩增LHCI基因；

3)回收PCR产物，获得目的基因；将其连接至质粒PEA7的启动子和终止子之间，即构建得LHCI功能基因表达载体；其中，启动子为紫菜PyAct1，终止子为NOS。

所述PCR扩增反应条件为：95℃变性30秒，65℃退火30秒，70℃延伸2分钟，共计35个循环。

一种紫菜功能基因过表达质粒的应用，其特征在于：所述质粒在条斑紫菜内过表达调控紫菜代谢。

将所述质粒通过基因枪的方法进行质粒转化，所述宿主为条斑紫菜叶状体。

具体为：

扩增目的基因的CDS序列，构建表达载体。用基因枪轰击质粒的方法把表达载体打进条斑紫菜叶状体中。在抗生素筛选压力下筛选存活藻株。验证基因转录表达情况。

具体步骤如下：

1)提取条斑紫菜总RNA，反转成cDNA，设计合适的引物扩增条斑紫菜功能基因的编码序列。