[发明专利]促进黄瓜小孢子分裂的方法以及黄瓜小孢子的培养方法

说明书

本发明公开了促进黄瓜小孢子分裂的方法以及黄瓜小孢子的培养方法。本发明公开的促进黄瓜小孢子分裂的方法包括：在33℃下利用纤维素酶和果胶酶处理处于单核靠边期的黄瓜小孢子2小时，以促进黄瓜小孢子分裂。利用本发明的促进黄瓜小孢子分裂的方法，不仅可以克服黄瓜小孢子壁障碍，还不影响小孢子内容物的完整性与活性，所得小孢子可以分裂与进一步发育，实现小孢子的培养，本发明的方法以及植物小孢子的培养方法可以用于制备黄瓜单倍体以及单倍体胚。

技术领域

本发明涉及领域生物技术中，促进黄瓜小孢子分裂的方法以及黄瓜小孢子的培养方法。

背景技术

黄瓜小孢子培养通过诱导黄瓜游离小孢子产生胚状体，再经过染色体加倍成二倍体,可以快速产生纯合的育种新材料(纯系)，提高育种效率，还可用作遗传转化的优良受体材料。此技术在国际上尚未建立起完善且稳定的培养技术体系，培养过程中的关键技术之一就是如何启动小孢子的孢子体分裂，但是由于小孢子外壁的坚硬结构，使得小孢子不能轻易突破孢子壁的物理限制，即使其他培养条件适合，也不能成功启动分裂发育。

普通的花粉破壁研究的目的是为了生产容易被人体吸收、营养丰富的花粉，因此强调的是花粉内容物的溢出，目前成功的花粉破壁技术如机械法、超声法、温差解冻法、水合破壁法、发酵法、酶法等等，而小孢子的外壁结构和花粉壁结构不完全相同。而且游离小孢子培养是在无菌环境下操作，对酶解处理的特异性、可操控性、广普性要求严苛，既要求对小孢子壁尤其是小孢子外壁造成轻微的破损，而且必须要保证小孢子内容物的完整、有活力，所以如何达到这些条件实现小孢子的培养，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何在保证小孢子内容物的完整、有活力的前提下克服小孢子壁障碍，以进一步实现小孢子的培养。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种植物小孢子的培养方法，所述方法包括：在33℃下利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子，得到酶解后的小孢子；培养所述酶解后的小孢子，实现植物小孢子的培养。

上述方法中，利用纤维素酶和果胶酶处理小孢子可包括：利用酶解液处理所述小孢子，得到所述酶解后的小孢子，所述酶解液中纤维素和果胶酶的浓度分别为7.5U/mL～30U/mL和15U/mL～60U/mL。

上述方法中，所述酶解液中纤维素和果胶酶的浓度分别可为14U/mL和38U/mL。

所述酶解液可为向基本提取液中添加纤维素酶和果胶酶得到的液体，所述基本提取液的成分及含量如下：硝酸钾(KNO₃)2500mg/L，七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)250mg/L，二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)750mg/L，硫酸铵((NH₄)₂SO₄)134mg/L，二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)150mg/L；碘化钾(KI)0.75mg/L，硼酸(H₃BO₃)3mg/L，一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O)5mg/L，七水硫酸锌(ZnSO₄·7H2O)2mg/L，二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25mg/L，六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O)0.025mg/L，五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025mg/L；二水合乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA)37.3mg/L，四水硫酸亚铁(FeSO₄·4H₂O)27.8mg/L；肌醇100mg/L，烟酸1mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，烟酸硫铵10mg/L；10-14mg/100mL蔗糖；余量为水，pH值5.8。