[发明专利]一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株

说明书

本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体提供了一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株及其应用。所述菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2019968，可广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，从而有利于降低鼠李糖苷酶的生产成本，促进其在食品加工领域中的推广与应用。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体内容涉及一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株及其应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC3.2.1.40)属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷(naringin)、芦丁(rutin)、橙皮苷(hesperidin)等末端的α-L-鼠李糖基。α-L-鼠李糖苷酶的来源广泛，在动物组织、植物和微生物中均发现了α-L-鼠李糖苷酶。目前关于动物组织和植物来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道相对较少，主要是通过细菌(如芽孢杆菌属、单胞菌属等)和真菌(如曲霉属、青霉属、木霉属、犁头霉属及裂殖菌属等)发酵来获取α-L-鼠李糖苷酶。

不同微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质存在差异。细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶最适pH呈中性或碱性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH一般在酸性范围内，主要在4.0-7.0之间。微生物中的α-L-鼠李糖苷酶的最适反应温度一般是45-60℃。近年来也有发现耐热、嗜低温及耐碱性的α-L-鼠李糖苷酶。

α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮苷酶的主要活性成分，是去除柑桔类果汁苦味的有效物质。果汁中的苦味物质柚皮苷被柚苷酶水解的过程共有两步反应，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮苷生成普鲁宁，接着在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脱苦过程中，α-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键。

微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一种诱导酶，需要诱导物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在时才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的诱导受到碳源代谢调节，给微生物发酵产α-L-鼠李糖苷酶造成阻碍。同时随着α-L-鼠李糖苷酶的应用越来越广泛，传统发酵的生产方式不能满足日益增长的需求，也很难达到很高的纯度。因此，选择现代生物技术来研究α-L-鼠李糖苷酶是一种必然趋势。

微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶具有很多潜在的应用价值，近年来，对该酶的研究越来越受到学者的关注。在α-L-鼠李糖苷酶产酶菌株的筛选、发酵条件的优化以及酶的分离纯化和性质研究日趋成熟，为产业生产α-L-鼠李糖苷酶酶制剂及α-L-鼠李糖苷酶在食品医药加工工业中的应用提供了一定的参考价值。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株及其应用。申请人首先将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的鼠李糖苷酶基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主中进行过表达，构建得到重组菌株；然后以该重组菌株为出发菌，进一步通过紫外诱变的方法获得鼠李糖苷酶产量得到显著提高的突变菌，能大幅度降低鼠李糖苷酶的生产成本，有利于促进该酶的广泛应用。

本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有表达鼠李糖苷酶基因的重组质粒。

本发明另一方面涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

所述突变菌株为毕赤酵母RhaAN-2(Pichia pastoris RhaAN-2)，已于2019年11月25日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019968。

本发明还涉及上述毕赤酵母菌株在鼠李糖苷酶生产中的应用。