[发明专利]一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化的方法

权利要求书

1.一种利用用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签和水溶性高分子聚合物进行蛋白质分离纯化的方法，其包括：

步骤K，将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段；

步骤L，表达带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，获得带有肽链标签的蛋白质；

步骤M，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白；

步骤N，在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质；

其中，所述肽链标签，其肽链长度为11个氨基酸，肽链中带有一个赖氨酸，其氨基酸序列如Sequence No.1所示，且在所述肽链中，赖氨酸的位点靠近N端；所述水溶性高分子聚合物的分子中带有与谷氨酰胺相似的结构，并且其能够通过用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签与蛋白质形成缀合结构。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性高分子聚合物的分子中带有谷氨酰胺单元结构。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽链的脱氧核糖核苷酸序列如Sequence No.2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤M中，将谷氨酰胺转氨酶加入到带有肽链标签的蛋白质和水溶性高分子聚合物的底物溶液中进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白，获得除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液；以底物溶液的体积计谷氨酰胺转氨酶的使用量为1wt％-3wt％；和/或，所述底物溶液由带有肽链标签的粗蛋白质溶液和水溶性高分子聚合物或其水溶液混合后形成；以底物溶液体积计含带有肽链标签的蛋白质的含量为5-10mg/mL，水溶性高分子聚合物的含量为3-5mg/mL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述交联的温度为20-30℃；和/或，交联时间为4-12小时。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤N中，向除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液中加入凝血酶，并在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质；以除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液的体积计，凝血酶的使用量为20-30U/mL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述切割的温度为20-37℃；和/或，切割的时间为3-12小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，切割的时间为3-9小时。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤L包括：

步骤B，将带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质的基因片段连接到载体上构建重组表达载体；

步骤C，重组表达载体转入宿主细胞，获得表达菌株；

步骤D，将表达菌株进行发酵培养，并以诱导剂进行诱导表达，然后将菌体破胞后重新悬浮，离心，收集上清液，获得带有肽链标签的粗蛋白质溶液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌；和/或，所述载体为pET32b(+)载体；和/或，所述诱导剂为IPTG，所述IPTG的加入量为发酵液体积的0.05％。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤D中，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，然后加入诱导剂进行诱导表达培养；和/或，所述发酵培养基为LB培养基；和/或，发酵培养的温度为37℃；和/或，诱导表达培养的温度为15-25℃。