[发明专利]用于结合曲妥珠抗体的核酸适体

说明书

本发明涉及一种用于结合曲妥珠抗体的核酸适体，其序列为SEQ ID NO.:1所示，或其一个或多个不降低其结合功能的突变。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及能够结合曲妥珠抗体的核酸适体及其应用。

背景技术

核酸适体是通过特定空间结构和靶标高特异性、高亲和力结合的一种单链寡核苷酸(参考文献1和2)。经过三十年的发展，核酸适体作为一种靶向识别工具被广泛应用于体外诊断(参考文献3和4)、靶向成像(参考文献5)、药物递送(参考文献6)等诸多领域。核酸适体的靶分子范围非常广泛，靶分子不仅可以是细胞因子、多肽等大分子，还可以是有机物、氨基酸、染料、金属离子等小分子(参考文献3和4)，与靶标结合的解离常数(Kd)可以在nM甚至pM水平。目前绝大多数的核酸适体都是通过体外的SELEX技术筛选获得(参考文献7和8)。SELEX技术即配体指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byEXponential enrichment)，可以从随机的单链核酸文库中筛选出与靶标特异性地高度亲和力结合的核酸适体序列(参考文献9)。传统的SELEX筛选过程包括以下几个步骤：(1)文库构建。通过合成构建一个库容量约为1013-15的单链寡核苷酸的文库。文库两端为固定序列，中间为20-60个碱基的随机序列。(2)筛选富集。将随机文库和靶标进行孵育，通过洗涤分离等技术富集与靶标分子高亲合力结合的核酸分子，淘汰不结合及弱结合分子。同时加入对负筛选，淘汰与负靶标结合的分子，提高筛选的特异性。(3)文库扩增。解离下可以结合靶标分子的核酸，以它为模板进行PCR扩增，生成次级文库，用于下一轮筛选。随着筛选轮数的增加，结合能力强的序列逐步富集。(4)序列表征。对最终富集文库进行测序，选出结合能力最佳且特异性最好的序列，表征其结合能力以及特异性。通过SELEX技术可以筛选出与各种靶标高特异性、高度亲和力结合的一条或者多条核酸适体序列，用于后续的研究。

基于核酸适体的检测制剂：核酸适体因其具有高亲和、高特异性、规模化合成易化学修饰合成等优势，常用于各类蛋白、小分子等的检测，如：人凝血酶(thrombin)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、黄曲霉毒素等的检测(参考文献10-13)。有别与传统的传统的酶联免疫吸附方法(ELISA)，核酸适体可以巧妙的设计为荧光探针，当核酸适体与靶标结合后发生构象变化，产生易于检测的荧光信号。如：Nutiu等设计了一种核酸适体探针，实现对ATP高灵敏检测(参考文献14)。Sharma等通过核酸适体结构转换以及荧光信号的变化测定了牛奶当中的黄曲霉毒素M1(AFM1)(参考文献15)。

曲妥珠单抗及其检测制剂和分离纯化方法：曲妥珠单抗(Trastuzumab)是人源化IgG1型单克隆单抗，商品名叫赫赛汀(Herceptin)，可与人源HER2靶点特异结合，它通过结合在HER2上阻止人体表皮生长因子与HER2的结合，同时使免疫细胞来杀伤癌细胞，从而阻断癌细胞的生长(参考文献16)。曲妥珠单抗由CHO细胞生产，纯化方式为使用Protein A的进行纯化，现有的检测手段主要为使用传统的ELISA的方法进行。目前为止尚未有针对曲妥珠单抗的核酸适体及基于核酸适体的检测制剂和分离纯化方法的报道。

参考文献：

1.Ellington AD,Szostak JW.结合特异性配体的RNA分子的体外选择。Nature,1990,346(6287),818.

2.Tsae PK,DeRosa MC.二十五年后适体的发展前景。Curr Top Med Chem.2015,15(12):1153-9.

3.Tombelli S,Minunni M,Mascini M.适体的分析应用.BiosensorsBioelectronics,2005,20(12):2424-34.

4.Famulok M,Mayer G.适体作为分子生物学和免疫学的工具,Curr TopMicrobiol Immunol.1999,243:123-36.