[发明专利]重组CL7-CVN蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种重组CL7-CVN蛋白，其特征在于，所述重组CL7-CVN蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种编码如权利要求1所述重组CL7-CVN蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种包含如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的重组CL7-CVN蛋白表达载体。

4.一种包含如权利要求3所述重组CL7-CVN蛋白表达载体的宿主细胞。

5.一种如权利要求2所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，通过将如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列克隆到原始表达载体上，得到重组CL7-CVN蛋白表达载体；将所述重组CL7-CVN蛋白表达载体转化到宿主细胞中进行诱导表达，分离纯化，得到所述重组CL7-CVN蛋白。

6.根据权利要求5所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组CL7-CVN蛋白表达载体为pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN，其制备方法如下：

(1) 第一PCR扩增：以pET23a-CL7质粒为模板，如SEQ ID NO: 6所示的F1，如SEQ IDNO: 7所示的R1为引物，进行PCR扩增，得到CL7-linker-His线性片段；根据gene bank公布的CVN基因序列，进行密码子优化设计合成CVN基因，并以构建的pET28a-CVN载体为模板，以如SEQ ID NO: 8所示的F2和如SEQ ID NO: 9所示的R2为引物，同时引入3C及末端同源序列，进行PCR扩增，得到3C-CVN线性片段；

(2) 第二PCR扩增：以pET28a质粒为模板，如SEQ ID NO: 10所示的F3和如SEQ ID NO:11所示的R3为引物进行载体PCR扩增获得pET28a载体的线性片段；

(3) 将所述第一PCR扩增和所述第二PCR扩增获得的CL7-linker-His、3C-CVN和pET28a载体的三个线性片段用T5核酸外切酶进行同源末端消化，产物进行常规转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选，得到所述重组CL7-CVN蛋白表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN。

7.根据权利要求6所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达步骤为：将所述重组表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到表达菌株，将所述表达菌株接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，培养至OD600值为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.25-1mM，18-37℃诱导表达12-20h。

8.根据权利要求7所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，所述分离纯化步骤为：离心收集诱导后的菌体，重悬后超声破碎，将破碎液离心后得到的上清液进行水浴热处理；再经离心处理，上清液与镍柱结合，依次用由低浓度到高浓度的咪唑缓冲液洗脱镍柱，收集高浓度的咪唑缓冲液，超滤浓缩后获得重组CL7-CVN蛋白。

9.一种CVN蛋白的制备方法，其特征在于，离心收集权利要求7诱导后的所述表达菌株菌体，重悬后超声破碎，将破碎液离心后得到的上清液进行水浴热处理；再经离心处理，上清液与镍柱结合，先用咪唑缓冲液洗脱镍柱，再用3C蛋白酶和3C蛋白酶切缓冲液洗涤并重悬镍柱，收集流穿液，超滤浓缩后获得所述CVN蛋白。

10.权利要求1-2、5-8任一项所述重组CL7-CVN蛋白、或权利要求9所述CVN蛋白在制备预防或治疗抗病毒耐热性药物中的应用，其特征在于，所述的病毒为伪狂犬病病毒。