[发明专利]RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法

说明书

本发明涉及RAP基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用,通过在白果草莓植株中过表达RAP基因得到红果草莓。本发明还提供了一种改变草莓果实颜色的育种方法，包括在白果草莓植株中过表达RAP基因的步骤。本发明提供了RAP基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用RAP基因过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。

技术领域

本发明涉及草莓育种技术领域，具体的，涉及RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法。

背景技术

草莓(Fragaria ananassa)为蔷薇科草莓属多年生草本植物，具有丰富的营养价值，位居世界小浆果生产之首。果实色泽是草莓育种的重要目标之一，而花青素是草莓果实变红的主要色素。植物细胞以苯丙氨酸为前体，在细胞质中经多步酶促反应合成花青素并储存于液泡中。花青素生物合成受两类基因的控制，分别称为结构基因和调节基因，其中结构基因在花青素合成途径中编码了一系列生物合成酶，且合成途径在各物种中非常保守，大致分为以下阶段：第一阶段前体苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4香豆酰辅酶A连接酶(4CL)的作用下转化成4-香豆酰CoA；第二阶段是4-香豆酰CoA和丙二酰CoA在查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄烷酮3’-羟化酶(F3’H)的作用下合成二氢黄烷醇；第三阶段是在二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS)、类黄酮糖基转移酶(UFGT)的作用下生成花青素。其中黄酮醇合酶(FLS)作为一个分支途径可将二氢黄烷醇形成黄酮醇，无色花色素还原酶(LAR)和花青素还原酶(ANR)可催化原花青素的形成。

花青素合成途径的结构基因主要受到调节基因在转录水平上的调控，其中研究最透彻的是R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40重复蛋白三者组成的复合体，称为“MBW”(MYB-bHLH-WD40)复合体。例如，R2R3-MYB转录因子MYB10在苹果、桃、油桃、樱桃和梨中均调控了果实颜色。在草莓中，多篇文章证实Fa/FvMYB10是正向调控果实颜色的关键转录因子，并且FvMYB10与FvbHLH33可能形成复合体促进结构基因的转录。最新研究发现因自然突变引起FvMYB10第12位氨基酸从W变为S，导致不同草莓生态型间红果(如Ruegen)和白果(如YellowWonder、Hawaii 4)的差异。具体来说，野生型白果森林草莓‘YellowWonder’(YW)和‘Hawaii4’(H4)均有红色叶柄、淡黄色的果皮、白色的果肉和瘦果；相反，野生型红果森林草莓‘Ruegen’具有红色叶柄、红色的果皮、白色的果肉和红色的瘦果，且果皮和瘦果着色是从果实发育后期的转色期开始的。对于FveMYB10来说，Ruegen是一个真正的野生型，而YellowWonder相当于该基因的缺失突变体。

除受合成途径的调控外，花青素的修饰和运输也直接影响了花青素最终的积累水平。花青素的稳定性受到糖基化、甲基化和乙酰化等修饰的调控。花青素在细胞质合成后需要运输到液泡中储存，因此花青素的运输也是调控花青素积累的重要环节。以玉米ZmMRP3为代表的MRP，以拟南芥TT12为代表的MATE，以及谷胱甘肽S-转移酶(GST，glutathione S-transferase)都具有运输花青素的作用。不同物种中的GST蛋白都可作为搬运蛋白(carrier)介导花青素的运输过程，如矮牵牛的AN9基因、玉米的BZ2基因以及拟南芥的TT19基因，其功能缺失后植株所有组织的花青素含量都显著下降。在桃中，GST编码基因Riant调控了桃花杂色。此前，Luo et al.，通过ENU诱变YellowWonder获得一个具有绿叶叶柄的突变体rap，但它实际上是rap myb10双突变体。基因克隆结果表明RAP编码GST蛋白，是草莓营养器官和果实着色的关键转运蛋白。现有结果表明，在草莓果实成熟过程中，FveMYB10诱导花青素合成酶和RAP基因大量表达，从而引起花青素积累，使果实着色；据此推断在FveMYB10缺失情况下，由于花青素合成受阻，RAP基因过表达也不会使白果草莓着色。

发明内容