[发明专利]可增强长牡蛎免疫应答的重组血清淀粉样蛋白A及制备方法

说明书

本发明公开一种可增强长牡蛎免疫应答的重组血清淀粉样蛋白A，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，在长牡蛎体外和体内均能显著促进血淋巴细胞中细胞因子CgIL17‑1、CgIL17‑5和CgTNF的基因表达，可增强长牡蛎的免疫应答水平，在制备贝类尤其是繁育种贝的新型免疫制剂等药物方面具有应用价值。

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，尤其涉及一种可增强长牡蛎免疫应答的血清淀粉样蛋白A及制备方法。

技术背景

长牡蛎（Crassostrea gigas，Cg）是我国重要的海水养殖经济贝类。近年来由细菌、真菌和病毒引起的多种疾病在长牡蛎的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。由于缺乏适应性免疫防御系统，长牡蛎主要依赖固有免疫反应抵御外源病原微生物的侵染。最新研究表明，病原长期潜伏感染，导致长牡蛎固有免疫应答能力不足进而引起内稳态失衡是长牡蛎大规模死亡的重要原因之一。在哺乳动物中，血清淀粉样蛋白A(Serumamyloid A, SAA)是炎性疾病急性反应期蛋白，其在血浆中的浓度会急剧增加，并常用于机体健康评价。迄今为止，尚未发现关于长牡蛎SAA生理功能的报道，亦未发现可显著促进长牡蛎固有免疫应答水平的药物。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可增强长牡蛎免疫应答的血清淀粉样蛋白A及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种可增强长牡蛎免疫应答的重组血清淀粉样蛋白A，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种上述的可增强长牡蛎免疫应答的重组血清淀粉样蛋白A的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 用特定引物P1和P2对长牡蛎血清淀粉样蛋白A基因编码区片段进行PCR扩增，所述特定引物P1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述特定引物P2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述PCR反应条件为： 94 ℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94 ℃变性30秒，57 ℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟；

b. 将扩增片段纯化回收并与pMD19-T载体连接，转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用BamH I和XhoI酶切质粒，对酶切质粒产生的目的片段纯化回收；

c. 将所回收的目的片段与经BamH I和XhoI酶切的表达载体pET-30a连接并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中培养；

d. 挑取单克隆，接种于200 mL的LB液体培养基中，220 rpm，在37 ℃下培养至OD ₆₀₀ =0.4~0.8，加入终浓度1 mmol L^-1的诱导剂IPTG后继续培养4小时，于4 ℃，5000 rpm，离心10分钟，收集菌体；

e. 将所得到的菌体纯化、复性，即得到可增强长牡蛎免疫应答的血清淀粉样蛋白A。

所述e步骤依次如下：

（1）镍琼脂糖凝胶 FF装柱，1.6×20 cm，柱床体积为10 mL；

（2）用缓冲液I平衡2~5个床体积，流速为2 mL min^-1；所述缓冲液I组成如下：50 mmolL^-1 Tris-Hcl缓冲液，pH 7.4；50 mmol L^-1 NaCl；8 mol L^-1尿素；