[发明专利]一种体外抑制大黄鱼内脏白点致病菌的抑菌组合物及其制备方法

说明书

本发明公开了一种体外抑制大黄鱼内脏白点致病菌的抑菌组合物及其制备方法，涉及抑菌组合物技术领域，所述抑菌组合物制备方法的步骤如下：S1.nisin‑B的提取：取产nisin‑B的乳酸乳杆菌K4在营养肉汤中进行过夜培养，取过夜的乳酸乳杆菌的培养液加入营养肉汤，进行恒温培养，第一次离心，取上清液，加入饱和硫酸铵，静置过夜，第二次离心，取沉淀，加入入无菌蒸馏水，制得nisin‑B的粗提物；S2.抑菌组合物的配制：将EDTA‑2Na溶于无菌水，再向其中加入nisin‑B的粗提物，混合均匀，制得抑菌组合物。

技术领域

本发明涉及抑菌组合物技术领域，具体涉及一种体外抑制大黄鱼内脏白点致病菌的抑菌组合物及其制备方法。

背景技术

大黄鱼肉质鲜嫩，营养价值高，是我国主要的近海经济鱼类。大黄鱼内脏白点病是近年网箱养殖大黄鱼较为常见的病害之一。相关研究显示假单胞菌属(Pseudomonas spp.)可能是引起大黄鱼内脏白点病的主要致病菌。一般网箱养殖户在大黄鱼内脏白点病爆发期间主要采取过量投放药物的方法抑制假单胞菌。然而过量的药物，特别是抗生物药物的过量投放容易造成养殖环境的恶化，更容易造成致病菌耐药性的产生。从病变的大黄鱼中分离的假单胞菌均带有耐药性质。特别是对青霉素、万古霉素、利福平、红霉素、呋喃唑酮、氯霉素、复合磺胺、呋喃妥因等抗生素具有一定的耐药性。因此，筛选合适的抑制假单胞菌属物质对解决大黄鱼内脏白点病害问题十分必要。

乳酸菌细菌素是一种由乳酸菌核糖体合成对亲缘细菌具有抑菌作用的多肽。目前唯一通过FDA/WHO允许添加到食品中的市售乳酸菌细菌素为Nisin(氨基酸序列为MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVS K)，以下称其为Nisin-A。Nisin的抑菌机理主要是锚定细菌细胞壁上的脂膜 II(lipid II)，造成细菌细胞结构松散，从而杀灭细菌。然而由于细菌细胞壁的结构不同，Nisin只对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，对革兰氏阴性菌抑制作用还未发现。因此，单独利用Nisin还不能抑制假单胞菌属(革兰氏阴性菌)。

一种从福建地区贝类中筛选出的新型Nisin(氨基酸序列为MSTKDFNLDLV SVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCNCSIHVSK),称其为Nisin-B。Nisi n-B是Nisin-A的变体，两者在抑菌上没有差别。Nisin-B从水产品中进行提取，更能适应水产品的生存环境，为抑菌提供更多选择。

目前现有技术中还未有用Nisin-B与EDTA-2Na混合制得抑菌组合物抑制大黄鱼内脏白点致病菌假单胞菌属的方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种体外抑制大黄鱼内脏白点致病菌的抑菌组合物制备方法，所述抑菌组合物制备方法的步骤如下：S1.nisin-B 的提取：取产nisin-B的乳酸乳杆菌K4在营养肉汤中进行过夜培养，取过夜的乳酸乳杆菌的培养液加入营养肉汤，进行恒温培养，第一次离心，取上清液，加入饱和硫酸铵，静置过夜，第二次离心，取沉淀，加入入无菌蒸馏水，制得 nisin-B的粗提物；S2.抑菌组合物的配制：将EDTA-2Na溶于无菌水，再向其中加入nisin-B的粗提物，混合均匀，制得抑菌组合物。

S1中所述乳酸乳杆菌K4和营养肉汤的重量份数比为1-3:100。

S1中所述过夜的乳酸乳杆菌的培养液体积为原培养液体积的1％，所述的加入营养肉汤的体积为1L，所述过夜培养的时间为24小时。

S1中所述恒温培养的条件：30℃，8h。

S1中离心条件：第一次离心，10000rpm，30min；第二次离心，9500rpm， 30min。

S1中所述上清液和饱和硫酸铵的体积比为100:45。

S1中所述无菌蒸馏水的加入量为20ml。