[发明专利]一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法，属于生物工程领域。本发明是以酿酒酵母BY4741野生型菌株或敲除了LSC1基因的酿酒酵母BY4741菌株为宿主，分模块过量表达T.fusca己二酸逆降解途径中的β‑酮硫解酶基因、3‑羟酰基‑辅酶A脱氢酶基因、3‑羟基己二酰脱氢酶基因、5‑羧基‑2‑戊烯酰辅酶A还原酶基因、己二酰辅酶A，己二酸的产量可达到0.033‑0.113g/L。以其优秀的抗逆性、耐酸性、遗传稳定性、食品安全性，为酿酒酵母宿主工业化发酵生产己二酸准备了基础。

技术领域

本发明涉及一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法，属于生物工程领域。

背景技术

己二酸(Adipic acid，adipate)又称肥酸，是一种重要的有机二元酸，广泛应用于化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造等方面。

目前己二酸的主要生产方式是化学合成，但是该方法的产品收率并不高。此外，在己二酸的化学合成过程中主要以苯为原料，通过化学方法合成，原料和中间产物毒性很强，而且过程中产生大量的N₂O等温室气体，环境污染严重且不可持续。

为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基础工作。目前报道的主要生物合成己二酸的方法有生物催化法和全生物合成方法。以葡萄糖为底物全生物合成己二酸具有工艺流程简单、总投入成本低、可循环利用等突出优点，因此备受研究人员青睐。目前报导主要的生物催化法主要是利用大肠杆菌作为宿主催化合成己二酸前体顺，顺-粘康酸，然后再利用金属催化剂催化合成己二酸。此外，大肠杆菌以葡萄糖为底物利用乙酰CoA和琥珀酰CoA作为底物全生物合成己二酸也达到了较高的产量。但大肠杆菌全生物合成己二酸存在着一些弊端，例如大肠杆菌属于原核生物、抗逆性较差、不耐酸、菌株遗传稳定性差，不易进行大规模工业发酵生产；另外大肠杆菌属于非食品安全菌株，其生物合成品不易运用于食品制造等领域。

基于以上问题，越来越多的研究者选择将酿酒酵母作为生物合成己二酸的宿主。酿酒酵母是一种最简单的真核生物，其遗传背景清晰、基因操作容易、遗传稳定性强、生命力旺盛、耐酸性和抗逆性强，并且，酿酒酵母可以生产多种类型的有机酸，并且存在着许多支持有机酸合成的内源代谢途径，并且，酿酒酵母是大规模工业发酵生产的最常用菌株之一。这使得酿酒酵母吸引了己二酸生物合成研究人员的极大的兴趣。其中，有研究人员利用酿酒酵母脂肪酸氧化法全生物合成己二酸，获得了较为理想的产量。目前，研究人员以酿酒酵母为宿主、以葡萄糖为底物从头合成己二酸有所报导，但产量较低，可能的原因是酿酒酵母宿主下以葡萄糖为底物从头合成己二酸并未找到合适的代谢途径。

自然界中存在着天然的己二酸合成或分解代谢途径，其中，褐色喜热裂孢菌的3-氧代己二酰辅酶A途径可以高效的利用己二酸，同时，当生长情况良好、碳源充足时，该途径也可以积累己二酸，因此，该途径又被称之为T.fu己二酸逆降解途径。途径中涉及到的六种酶分别是：β-酮硫解酶(Tfu_0875)，3-羟酰基-CoA脱氢酶(Tfu_2399)，3-羟基己二酰-CoA脱氢酶(Tfu_0068)，5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶(Tfu_1648)和琥珀酰CoA合成酶(Tfu_2576、Tfu_2577)。然而，由于缺乏对该菌株进行基因工程改造的工具，提高己二酸的含量很困难。相比目前报导的己二酸生物合成途径，该Tfu己二酸逆降解途径的效率更高，可以以极高的得率通过葡萄糖等碳源底物生产己二酸。目前，在大肠杆菌中重构该途径，可以使己二酸的产量达到68g/L，为报导的最高值。然而，该菌株在实际生产过程中，存在如下缺陷：1、耐酸性差，菌株在pH低于5时会发生裂解；2、补料成本高：生产时须使用成本较高的葡萄糖等碳源进行发酵；3、发酵温度所需的能耗高：由于大肠杆菌所需的发酵温度为37℃，对能源的需求高。

从理论上来说，结合Tfu己二酸逆降解途径的优势，以及酿酒酵母宿主的优势，不仅可以获得较高的己二酸产量、产率，还可以克服大规模工业化生产遇到的种种问题，如菌株抗逆性、耐酸性、遗传稳定性等，是一种良好的策略。

发明内容