[发明专利]一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法

说明书

本发明属于细胞染色领域，具体涉及一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法。所述方法为：将卵母细胞转移至酶标孔，滴加水凝胶覆盖卵母细胞并进行光固化；随后进行4％多聚甲醛固定、Triton‑X100透化、1％BSA或山羊血清封闭，再进行一抗孵育、二抗孵育、DAPI染色。本发明针对卵母细胞这种体积大、数量有限、不贴壁、不增殖的细胞，采用水凝胶包裹技术进行细胞免疫荧光染色，所述水凝胶具有良好的生物相容性及通透性，整个免疫荧光染色过程均在水凝胶封闭的酶标孔中进行，避免了传统卵母细胞免疫荧光染色过程中，口吸管多次转移所造成了卵母细胞丢失、操作繁琐、效率较低等问题，染色效果较好，十分适用推广。

技术领域

本发明属于细胞染色领域，具体涉及一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法。

背景技术

哺乳动物中，卵母细胞在卵巢内卵泡中生长和发育。卵母细胞的成熟(细胞质和细胞核成熟)对于成功受精、胚胎发育等过程至关重要，并影响最终妊娠结果。卵母细胞免疫荧光染色是在各项卵母细胞研究中必不可少的技术之一。目前较为通用的卵母细胞免疫荧光染色方法是在整个染色过程中，持续用口吸管转移卵母细胞进行固定、透化、封闭、染色、洗涤等实验操作。口吸管的多次转移难免造成卵母细胞丢失、操作繁琐、效率较低等问题。

水凝胶(Hydrogel)是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，由于存在交联网络，水凝胶可以溶胀和保有大量的水。凝胶的聚集态既非完全的固体也非完全的液体。固体的行为是一定条件下可维持一定的形状与体积，液体行为是溶质可以从水凝胶中扩散或渗透。水凝胶在细胞培养、细胞筛选等生物医学领域有着广泛的应用，但是关于一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法目前还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种基于水凝胶包裹技术的卵母细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：

(1)将卵母细胞经口吸管转移至酶标孔中央，沿孔壁滴加适量一定浓度的水凝胶覆盖卵母细胞并进行光固化，随后用PBS缓冲液洗涤；

(2)向酶标孔内加入4％多聚甲醛固定，随后用PBS缓冲液洗涤；

(3)向酶标孔内加入Triton-X100透化，随后用PBS缓冲液洗涤；

(4)向酶标孔内加入1％BSA或山羊血清，室温下封闭，吸干表面液体，加入一抗，4℃冰箱孵育过夜或室温孵育8h，随后用PBS缓冲液洗涤；

(5)再避光加入荧光标记的二抗室温下孵育，随后用PBS缓冲液洗涤；加入DAPI，室温避光孵育30min，然后用PBS缓冲液洗涤；最后加入抗荧光淬灭剂，置于显微镜下观察。

上述方案中，步骤(1)所述水凝胶为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)。

上述方案中，步骤(1)所述水凝胶的加入量为30～60μL，所述水凝胶的浓度为5％～10％。

上述方案中，步骤(1)所述光固化的参数为405nm波长的可见蓝光照射固化30s～60s。

上述方案中，步骤(2)所述多聚甲醛固定的时间为30～40min，随后用PBS缓冲液洗涤的时间为20～30min，重复洗涤三次。

上述方案中，步骤(3)所述Triton-X100透化的时间为30～40min，随后用PBS缓冲液洗涤的时间为20～30min，重复洗涤三次。

上述方案中，步骤(4)所述室温下封闭的时间为1～2h。