[发明专利]一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体诱导愈伤组织的遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体的遗传转化方法，其特征在于：利用萌动后露白高粱种子作为农杆菌侵染对象，并以其做外植体诱导愈伤组织发生，经过筛选培养，得到抗性愈伤组织，再经过继代、分化、生根、移栽得到再生转化植株；

具体步骤如下：

1）外植体的准备：挑选成熟饱满高粱种子，用自来水冲洗除去表面杂质，无菌条件下75%的酒精消1min，30%的双氧水消毒1.5-3.0 h；无菌水冲洗6 遍，将消毒后的种子置于装有无菌水的组培瓶中，25℃培养24 h，待其萌动露白后备用；

2）农杆菌的活化：将含有目标基因质粒的农杆菌菌株在冰中融化，接种于含有25mg/L草甘膦的YEP 液体培养基中，于28℃、220 r·min-1摇床培养过夜；菌液OD600=0.6-0.8时，将菌液8000 rpm离心，收集沉淀，用侵染培养基悬浮制作OD600=0.8的侵染液，加入乙酰丁香酮于28℃混匀后待用；其中：侵染培养基为：MS+水解酪蛋白氨基酸1 g/L+麦草畏5 mg/L+蔗糖65 g/L+葡萄糖30 g/L；

3）侵染：将萌动露白的高粱种子放到含侵染液的试管中，最大速度涡旋10s，然后室温静止5 min；弃去菌液，用无菌滤纸吸干残留的侵染液后接于共培养基中，25℃下暗培养3d；其中共培养基为：MS +蔗糖20 g/L+葡萄糖10 g/L+2-（N-吗非啉）乙磺酸500 mg/L+琼脂8g/L+ 麦草畏5 mg/L，高压灭菌后加乙酰丁香酮100 µMmol/L；

4）诱导愈伤组织：将萌动种胚转到愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-12 d；其中愈伤组织诱导培养基为：MS+ 麦草畏5 m/L +KT3mg/L +蔗糖20 g/L+磷酸二氢钾1.53 g/L+Gelrite 2.4 g/L +硝酸银5 mg/L+酸水解酪蛋白氨基酸100 mg/L；头孢噻肟钠250 mg/L；

5）筛选存活的胚性愈伤组织：将愈伤组织转入含有25mg/L草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养14 d；其中筛选培养基为：MS+麦草畏5 m/L +KT0.3 mg/L+蔗糖20 g/L；KH₂PO₄1.53 g/L+Gelrite2.4 g/L+硝酸银5 mg/L+酸水解酪蛋白氨基酸100 mg/L+头孢噻肟钠250mg/L+25 mg/L草甘膦；

6）再生培养：将筛选后存活的胚性愈伤组织转移到再生培养基上，26℃光照，16小时光照8小时黑暗循环下培养至少10-12d；其中再生培养基为MS+KT 0.5mg/L+蔗糖20g/L+KH₂PO₄1.53 g/L+Gelrite 2.4 g/L+头孢噻肟钠250 mg/L+25mg/L草甘膦；

7）生根培养：转移全部的已分化的植株到生根培养基上，26℃-28℃光照条件下培养直到生根；其中生根培养基为：1/2MS +蔗糖20 g/L +Gelrite 2.4 g/L +头孢噻肟钠250 mg/L；

8）所获得的再生苗移栽于温室或大田；

步骤2）中所述农杆菌菌株为LBA4404，内含pM3301UbiSpCP4质粒，携带的目标基因为CP4-EPSPS，质粒目标基因CP4-EPSPS受组成型强启动子-玉米泛素启动子pZmUbi-1启动表达和NOS终止子调控，该基因既作为目的基因，又作为筛选标记。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤3）中侵染的萌动露白的高粱种子，胚根或胚芽伸出1-3mm时农杆菌侵染；每皿10-20粒侵染后的萌动种子。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的以高粱成熟胚为外植体的遗传转化方法，其特征在于：步骤5）中将愈伤转到筛选培养基上，每皿18-22个，28℃暗培养14 d。