[发明专利]一种宿主米曲霉敲除系统及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种宿主米曲霉表达系统在降低米曲酶对潮霉素抗性中的应用，其特征在于，所述宿主米曲霉表达系统的构建方法，步骤如下：

（i）将重组质粒pBluescript-hph-rfp的多克隆位点上通过酶切连接的方法构建上敲除同源臂；

（ii）将活化后的米曲霉菌丝加入到细胞壁裂解酶溶液中，在30℃下酶解2.5小时，过滤并离心，STC溶液悬浮，制得感受态原生质体；然后加入步骤（i）制得的含有敲除同源臂的重组质粒，在质量百分比60%的PEG4000溶液环境中，室温放置25 min，制得转化原生质体；

所述细胞壁裂解酶溶液组份如下，均为质量百分比：

1% 纤维素酶、1% 裂解酶、0.15% 蜗牛酶、余量为浓度0.7 M的NaCl水溶液；

（iii）将步骤（ii）制得的转化原生质体在26～29℃、含有潮霉素的完全培养基中进行筛选培养70～75h，选取转化子，基因验证，制得宿主米曲霉表达系统；

所述重组质粒pBluescript-hph-rfp，采用如下方法制备：

（1）以pCSR1::hph质粒为模板，进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段；

所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述：

（2）以pDB790，进行PCR扩增，获得红色荧光蛋白表达基因片段；

所述PCR扩增的特异引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述：

（3）以步骤（1）制得的潮霉素抗性基因片段和步骤（2）制得的红色荧光蛋表达基因片段为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所述的引物经overlap PCR扩增，制得HPH+RFP表达元件；

（4）将载体pBluescript和步骤（3）制得的HPH+RFP表达元件经限制性内切酶EcoR Ι和BamH Ι双酶切，然后进行连接，制得重组质粒pBluescript-hph-rfp。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增体系如下：

10×taq buffer(+Mg²⁺) 10 μl

dNTP mix 8 μl

HPH-F 4 μl

HPH-R 4 μl

模板DNA 0.5 ul

Taq DNA聚合酶 2μl

DdH2O 71.5 μl

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5 min；94℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸5min。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，PCR扩增体系如下：

10×taq buffer(+Mg²⁺) 10 μl

dNTP mix 8 μl

RFP-F 4 μl

RFP-R 4 μl

模板DNA 0.5 ul

Taq DNA聚合酶 2μl

DdH2O 71.5 μl

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5 min；94℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。