[发明专利]制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体及检测方法

说明书

一种制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体，属于生物技术领域。本发明的目的是制备MYBPC3‑C0抗体，特异性结合MYBPC3，用于建立侧向免疫层析法（Lateral flow immunoassay,LFIA）检测MYBPC3试剂盒。本发明构建标签‑MYBPC3‑C0重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签‑MYBPC3‑C0蛋白，纯化标签‑MYBPC3‑C0蛋白为MYBPC3‑C0抗原。本发明灵敏度高，特异性强，快速检测血液中MYBPC3浓度，用于早期诊断AMI发生。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及免疫学和蛋白化学。

背景技术

诊断急性心肌梗塞(Acute myocardial infarction,AMI)金标准血液指标为肌钙蛋白T（Cardiac troponin T，cTnT），但血液中cTnT水平在AMI初始阶段非常低,使得早期诊断AMI变得困难。

AMI理想标志物是在心肌梗塞后，从心肌细胞快速释放到血液中，而心脏肌球蛋白结合蛋白C (Myosin-Binding Protein C, Cardiac-Type，MYBPC3或cMyBP-C )更符合这一标准。

MYBPC3有1273个氨基酸，分子量为140KDa结构蛋白。MYBPC3属于Ⅲ型纤连蛋白超家族和免疫球蛋白超家族，含有３个Ⅲ型纤连蛋白结构域（Fibronectintype3，FN3）和８个免疫球蛋白样结构域（Immunoglobulin,Ig），Pro-Ala结构域（PAdomain），Myosin(S2)结合区（Mdomain）。FN3是两片反向平行的β⁃链形成的层状结构，含FN3的多为受体蛋白；Ig由约70-110氨基酸组成，是两层反向平行的β⁃折叠链形成的层状结构，看图1MYBPC3蛋白结构示意图。

MYBPC3参与肌节蛋白的结构和功能，MYBPC3的C10结构域与肌球蛋白纤维结合，而C8～C10结构区域结合肌联蛋白（Titin），有稳定肌小节结构作用。MYBPC3在C1和C2结构域之间有个特定区域，M domain与肌球蛋白（Myosin）颈部结合，也是MYBPC3磷酸化部位（Phosphorylation sites），作为cAMP依赖的蛋白激酶以及钙调蛋白依赖的蛋白激酶的作用位点，磷酸化心肌特定的模序调节心肌收缩力，MYBPC3不仅参与心肌结构的维持，还参与细胞内信息传递，影响肌丝的舒缩运动。

机体内存在3种不同的MyBP-C异构体，通过不同基因编码，但3种MyBP-C异构体氨基酸序列有很高同源性。与骨骼肌型（MYBPC1）相比较，MYBPC3-N端（1-157氨基酸残基）是独特结构域（C0)并具有特异性抗原表位，可用免疫学方法特异性测定出心脏型 MYBPC3。

MYBPC3是高度磷酸化的蛋白,能增强对蛋白降解酶的抵抗力, 而273S和282S部位去磷酸化有助于 MYBPC3 降解，释放30-40KDa MYBPC3-N 端片段 (C0C1f)到循环中，提高血液中C0C1f水平。

MYBPC3是心肌细胞特有的粗肌丝结构蛋白之一，AMI发生时，血清MYBPC3浓度快升高，主要由于MYBPC3具有高度的可溶性及对蛋白水解酶非常敏感，在心肌缺血时，蛋白水解酶被启动并水解粗肌丝蛋白，MYBPC3去磷酸化，降解并释放入血流，导致血液中MYBPC3片段浓度在短时间内急剧升高。

AMI发生后3小时，血液中MYBPC3水平已升高，6小时达高峰，12小时后，MYBPC3恢复至基线水平；而血液中cTnT水平在6-12小时后增高。

研究发现，需要3-9mg 心肌坏死时，能测出cTNT水平增高；而0.07mg心肌坏死时，就能测出MYBPC3水平增高。由于MYBPC3分子量大，在AMI超早期，完整的MYBPC3及其水解产物持续大量释放入血，能高于cTNT数倍，甚至数十倍，易于检测，测定血液中MYBPC3浓度，可成为超早期诊断AMI敏感和特异性指标。

发明内容